综合测定方法.docVIP

实验1 植物体内硝态氮含量的测定 ? 植物体内硝态氮含量可以反映土壤氮素供应情况，常作为施肥指标。另外，蔬菜类作物特别是叶菜和根菜中常含有大量硝酸盐，在烹调和腌制过程中可转化为亚硝酸盐而危害健康。因此，硝酸盐含量又成为蔬菜及其加工品的重要品质指标。测定植物体内的硝态氮含量，不仅能够反映出植物的氮素营养状况，而且对鉴定蔬菜及其加工品质也有重要的意义。 传统的硝酸盐测定方法是采用适当的还原剂先将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再用对氨基苯磺酸与α-萘胺法测定亚硝酸盐含量。此法由于影响还原的条件不易掌握，难以得出稳定的结果，而水杨酸法则十分稳定可靠，是测定硝酸盐含量的理想选择。 一、 原理 在浓酸条件下，NO3―与水杨酸反应，生成硝基水杨酸。其反应式如下： 生成的硝基水杨酸在碱性条件下（pH12）呈黄色，最大吸收峰的波长为410nm，在一定范围内，其颜色的深浅与含量成正比，可直接比色测定。 二、仪器与用具 分光光度计；天平（感量0.1mg）；20ml刻度试管；刻度吸量管0.1ml、0.5ml、5ml、10ml各1支；50ml容量瓶；小漏斗（φ5cm）3个；玻棒；洗耳球；电炉；铝锅；玻璃泡；7cm定量滤纸若干。 三、试剂 (1)500mg/L 硝态氮标准溶液：精确称取烘至恒重的KNO3 0.7221g溶于蒸馏水中，定容至200ml。 (2)5%水杨酸─硫酸溶液：称取5g水杨酸溶于100ml比重为1.84的浓硫酸中，搅拌溶解后，贮于棕色瓶中，置冰箱保存一周有效。 称取15g水杨酸溶于300ml比重为1.84的浓硫酸中，搅拌溶解后，贮于棕色瓶中，置冰箱保存一周有效 (3)8%氢氧化钠溶液：80g氢氧化钠溶于1L蒸馏水中即可。 160g氢氧化钠溶于2L蒸馏水中即可。 四、方法 1．标准曲线的制作 （1）吸取500mg/L 硝态氮标准溶液1ml、2ml、3ml、4ml、6ml、8ml、10ml、12ml分别放入50ml容量瓶中，用无离子水定容至刻度，使之成10、20、30、40、60、80、100、120mg/L的系列标准溶液。 （2）吸取上述系列标准溶液0.1ml，分别放入刻度试管中，以0.1ml蒸馏水代替标准溶液作空白。再分别加入0.4ml 5%水杨酸—硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20min后，再加入8% NaOH溶液9.5ml，摇匀冷却至室温。显色液总体积为10ml。 （3）绘制标准曲线：以空白作参比，在410 nm波长下测定光密度。以硝态氮浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线并计算出回归方程。 2．样品中硝酸盐的测定 （1）样品液的制备 取一定量的植物材料剪碎混匀，用天平精确称取材料2g左右，重复三次，分别放入三支刻度试管中，各加入10ml无离子水，用玻璃泡封口，置入沸水浴中提取30min。到时间后取出，用自来水冷却，将提取液过滤到25ml容量瓶中，并反复冲洗残渣，最后定容至刻度。 （2）样品液的测定 吸取样品液0.1ml分别于三支刻度试管中，然后加入5%水杨酸—硫酸溶液0.4ml，混匀后置室温下20min，再慢慢加入9.5ml 8%NaOH溶液，待冷却至室温后，以空白作参比，在410nm波长下测其光密度。在标准曲线上查得或用回归方程计算出硝态氮浓度，再用以下公式计算其含量。 NO3—﹣N含量= 式中 C－标准曲线上查得或回归方程计算得NO3—﹣N浓度； V—提取样品液总量； W—样品鲜重。 ? 实验2 硝酸还原酶活性测定 硝酸还原酶是植物氮素代谢中的关键酶之一，它与作物吸收利用氮肥有关，对作物的产量和品质有影响。因而可以把硝酸还原酶的活力当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理与方法。 一、原 理 硝酸还原酶能将NO3－还原成NO2－ 产生的NO2－的量与硝酸还原酶的活性相关。通过测定反应液中产生的NO2－含量，即可确定酶活性大小。 NO2－含量可用磺胺显色法测定。NO2－与磺胺及 a－萘胺在酸性条件下生成红色偶氮化合物 其反应如下： 酶活性可用单位鲜重组织在单位时间内产生的亚硝酸量来表示： 亚硝酸态氮微克数/克鲜重组织1小时。 二、实验材料、仪器和试剂 1．实验材料 植物的根、茎、叶，本实验选用白萝卜叶片 2．仪器 （1）分光光度计（2）离心机（3）真空泵和真空干燥器 （4）恒温水浴锅（5）恒温箱（6）刻度吸管（lml、2ml、5ml） （7）试管 （8）天平 （9）三角瓶（50ml） 3．试剂 （1） 亚硝酸钠标准液：称取0.1000g亚硝酸钠（AR），用蒸馏水溶解并定容至100ml