质粒DNA的碱变法提取 分子生物学实验.docVIP

质粒DNA的碱变法提取、纯化和检测 史倩 201005140081 10级生命基地 同组者：阎珍珍、张姗 一、实验目的 1.利用碱变法从大肠杆菌DH5（E.coli DH5）中提取pUC19质粒 2.学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术 二、实验原理 1.质粒概述: 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%-3%,大小在1Kb-200Kb之间。 质粒由于分子小、便于分离和提取，在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，因此是基因工程中一种非常重要的载体，质粒特征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。近年来由于基因芯片技术的出现，质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展，所以这就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA，质粒提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。 2. 质粒DNA的提取、纯化和检测： 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱裂解法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典，适用于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。 碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 在细菌细胞中，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。当用pH值4.6的KAc（NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 三、实验仪器和材料试剂 1.实验仪器 培养皿、接种环、三角瓶（100ml、300ml）、酒精灯、恒温振荡培养箱、50ml离心管、1.5ml塑料离心管（eppendorf管）、高速离心机、漩涡振荡器、微量移液器、不同型号枪头、电泳仪、微波炉、灭菌锅、恒温水浴锅、试剂瓶、卫生纸和记号笔等。 2.实验材料 菌体：E.coli DH5受体菌，具有Amp标记的质粒pUC19。 3．实验试剂 LB液体培养基（600ml）：0.5%葡萄糖3g，1%蛋白胨(Tryptone) 6g，0.5%酵母提取物(Yeast extract) 3g，1%NaCl 6g，溶于400ml去离子水中，用NaOH调pH至7.2，加去离子水至总体积600ml，分装：20mlLB/100ml三角瓶（×10）,50mlLB/300ml三角瓶（×8）。121℃高压蒸气灭菌20分钟。 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。(1M Tris-HCl，12.5ml pH 8.0；0.5M EDTA 10ml pH 8.0 ，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃ 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。(使用前用10M的NaOH和10%的SDS母液配置，防止NaOH吸收空气中的H2O和CO2而减弱了碱性）。 溶液Ⅲ：5M醋酸钾（KAc）缓冲液60ml，冰醋酸11.5ml，重蒸水28.5ml，溶液中浓度K3M,Ac5M。 TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 无水乙醇。 70%乙醇。 RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L