质粒DNAD的制备.doc

质粒DNA的制备、鉴定、转化及目标基因的诱导表达 张翔宇 091130158 指导老师：陈浩 南京大学化学化工学院 南京 210046 摘要：在本实验中，我们培养了具有抗药性的大肠杆菌E.coli DH5,使目的基因质粒 DNA pET-28a 大量扩增。然后用碱裂解法裂解大肠杆菌。以大肠杆菌 BL21 （DE3）菌株为受体细胞，用 CaCl2法处理受体菌使其处于感受态，与质粒共保温实验转化。在含有抗生素卡那霉素的培养基培养受体细菌筛选得成功转化的受体细菌。用 IPTG 诱导受体细菌表达目的蛋白 czcS。用琼脂糖凝脂电泳方法分析提取的DNA样品，用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分析诱导表达 0 h、0.5 h、1 h和 1.5h后的结果，可以发现目的蛋白成功得到表达，而且诱导时间越长，表达量越多。 关键词：质粒 DNA，碱裂解，凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳， czcS蛋白 Abstract：In this experiment, Escherichia coli DH5 was used as host cell to multiply target gene, Plasmid DNA pET-28a. Then, Alkaline lysis method was used to decompose Escherichia coli. After that, Escherichia coli BL21 （DE3）, in competence using CaCl2, was used as receptor to finish transformation via mixed together with Plasmid at 42℃. Finally, transformed cell are selected and cultured on LB medium with kanamycin. The expression of target protein czcS was induced by the presence of IPTG. Agatose gel electrophoresis was used to analyze purity of plasmid. The amount of expression of czcS protein was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis after 0 h, 0.5 h, 1 h, 1.5h. We found czcS protein was successfully expressed, and expression was increased with time. Key words：plasmind DNA, alkaline lysis method, gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, protein czcS. 前言： 1、分子克隆的载体 将外源DNA片段带入宿主细胞并进行复制的运载工具称为克隆载体（vector）, 克隆载体含有在受体细胞内复制的起点，是一个能自主复制的复制子，通常由质粒、病毒、或一段染色体DNA改造而成。细菌与真菌的克隆载体常用质粒来构建，动植物的基因载体更多是用病毒或染色体DNA构建。作为克隆载体最基本的要求是：（1）具有自主复制能力;（2）携带易于筛选的选择标记; (3)含有多种限制酶的单一识别序列一共外源基因插入；（4）除保留必要序列外，载体应尽可能小，便于导入细胞进行繁殖；（5）使用安全。从安全性上考虑，克隆载体应只存在有限范围的宿主，在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开工程宿主自由扩散。此外根据不同目的还有各种特殊的要求。 构建载体时，通常需要选择适当质粒，病毒或染色体复制子作为基础序列，删除其中非必需序列，然后插入或融合选择标记序列。最常用的选择标记是对抗生素的抗性基因，如抗氨苄青霉素（amp r ）等。利用营养缺陷型宿主可以将相应生物合成基因作为标记，带有合成基因的载体可使宿主细胞在基础培养基中生长，无需补充原来所缺的营养成分。如果抗性基因位于转座中，可通过转座作用转入载体。当载体过大时，常用限制酶将其切成小段，再随机连接，并用选择培养基选出带有抗性、拷贝数多、长度较小的载体，此过程称为分子重排。在构建载体时保留一些限制酶的切点作为外源DNA插入位点。 质粒是双链的闭环DNA分子，是细菌内的共生遗传因子，可以在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。它是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位，但又依赖于宿主编码的酶和蛋白质进行复制和转录。作为自