酶基因的随机突变.docVIP

酶基因的随机突变 1 引言： 酶分子的定向进化简称为酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。 酶定向进化的基本过程包括随机突变，构建基因文库，定向选择等步骤。酶的定向进化的第一步是在体外人为的进行积阴德随机突变，以获得丰富多样的突变基因，为后续的定向选择打下基础。 酶基因的体外随机突变首先要获得酶基因，然后在体外进行随机突变，体外随机突变的技术多种多样，主要有易错PCR技术，DNA重排技术，基因家族重排技术等。 这些突变方法的目标都是为了获得丰富多样的突变基因，但是各自采用的进化策略和侧重点有所不同，易错PCR技术是从酶的单一基因出发，通过改变聚合酶链式反应的条件，如改变底物和镁离子浓度等，在PCR扩增过程中，使碱基配对错误而引起基因突变；DNA重排技术是从两条以上的正突变基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使DNA碱基序列重新排布而引起的基因突变；基因家族重排技术是从基因家族的多个同源基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增等，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变。这些随机突变方法可以单独使用，也可以联合使用，交叉进行，通过多次试验，反复筛选，就可以完成对酶的定向进化。 2 酶基因的随机突变常用技术： 2.1，易错PCR技术：在DNA聚合酶的作用下进行体外DNA扩增的一种分子生物学技术，简称为PCR技术。聚合酶链式反应技术的基本过程包括双链DNA的变性，引物与单链DNA退火结合，引物延伸三个步骤。 2.1.1，双链DNA的解链：将待扩增的模板DNA升温至85~95度，使DNA双链之间的氢键断开，解离为单链DNA。 2.1.2，引物与单链DNA退火结合：单链DNA在温度逐步降低至50~70度是，会与碱基互补的引物结合形成双链，长度为15~30个碱基。 2.1.3，引物延伸：引物结合后，将温度升高至70~75度，在DNA聚合酶的作用下，以引物为起点，以4种脱氧核苷三磷酸为底物，以目标DNA为模板，按照碱基配对原则，由5—端向3—端的方向延伸，而进行DNA复制。 以上三个步骤反复进行，一般经过30次循环，即可使目的基因扩增几百万倍。在PCR技术的基础上，通过改变反应条件，增加碱基配对错误的出现频率，就成为易错PCR技术。 2.2 DNA重组技术：又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，勇酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，是DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。DNA重排技术是1994年由斯田沫等首次提出，他们通过该技术对β—内酰胺酶进行了定向进化研究，是该酶的催化效率提高了32000倍。DNA重排技术的基本过程如图所示： 2.3基因家族重排技术：又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，勇酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR技术，使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。基因家族重排技术的主要过程如图所示： 3 酶基因随机突变的应用： 酶基因的随机突变时酶定向进化的第一步，所以特别重要。定向进化技术主要用于酶的改性方面，如提高酶催化的效率，增强酶的稳定性，改变酶的底物特异性等方面。 3.1 提高酶的催化效率：β—内酰胺酶是一种催化β—内酰胺水解的酶，在该酶的作用下，可使β—内酰胺类抗生素的内酰胺结构被破坏而失去活性。1994年，斯田沫等通过DNA重排技术进行定向进化，使β—内酰胺酶的催化效率提高32000倍，大大提高了突变菌株对于抗生素的耐受能力。 3.2 增加酶的稳定性：α—淀粉酶是一种在食品、医药、轻工等领域有广泛用途的催化淀粉水解的工业用酶，乔耶等通过定向进化，获得热稳定性大大提高的α—淀粉酶，该酶在90度的半衰期延长9~10倍。 3.3 改变酶的底物特异性：底物特异性是酶催化作用的最重要特性，通过酶定向进化可以改变酶催化作用的底物特异性，使酶对某种底物的特异性提高或者降低，甚至呈现出另一种酶的催化活性。