引物合成及各种问题总结.doc

引物合成及各种问题总结（2） admin 1.如何测定引物的OD值？ 用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。 举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。 2.怎样溶解引物？ 我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L（即100pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH6.0）或TE缓冲液（PH 7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。 3.合成的引物应如何保存?没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次冻融会降低使用寿命）。使用前，将浓溶液稀释成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后进行实验。 4.如何检测引物的纯度？ 实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,12个碱基的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，60个碱基的引物用12%的胶，取0.2OD左右的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带)。 5.一般的合成的引物在5和3末端有磷酸基团吗?没有，5和3末端均为-OH基。如需要加磷酸基团，订货时请特别注明，此时需收取磷酸化的费用。 6.合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。 1) 引物和模板是否配对，同源性有多大?2) 引物本身是否有立体结构.3) PCR反应用试剂是否能正常工作?4) PCR仪是否工作正常?5) PCR反应条件是否合适?如果一切正常，还无法解决问题时，我们可以免费重新合成引物。 7.测定了引物的OD值后发现A260/A2801.8，引物的纯度合格吗?由于核酸在260nm附近有强吸收，而蛋白质在280nm附近有强吸收，从生物体内提取核酸时，常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8～2.0之间)，这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同，序列很短 (通常在20～30个碱基之间)，其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同，由于各种碱基的摩尔消光系数不同，因此不同碱基构成的引物的A260/A280比值也不同， 例如当序列中C、T碱基的含量高时，该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度.8.上海生工公司可以合成多长的序列？ 由于用户和基因拼接的要求，我们很好地合成过不少100碱基左右长度的长片段。因为我们可以提高起始合成数量、加大合成用的试剂量、用PAGE纯化。如果您的实验需要，我们愿意接受110碱基以下的订单。 9.PCR产物经过克隆以后测序发现引物区与合成序列不相符合，怎么办？ 我们认为这多数是PCR过程和克隆过程中引入的错误。遇到这种情况，请您： 1) 可以要求我们重新免费合成引物。 2) 重新挑取克隆测序，会有找到正确克隆的可能.10.如何将两条互补的单链退火形成双链？ 用退火缓冲液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500微升，加热到95℃ 2mins，然后缓慢冷却至室温(低于30度)即可。退火的产物可以放在4度待用。 11.使用3%的Agarose凝胶电泳分析合成的引物，发现有很多条泳带，为什么?对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带，更无法用Agarose电泳进行定量了。 12.能否根据引物电泳后EB染色后条带的