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南台科技大學 生物科技大學部 建立心肌細胞缺血缺氧及再灌流 導致細胞凋亡模式之功能性評估平台 生：496H0107呂忠裕496H0012余宗澤496H0007尤俊傑 指導教授：張菁萍 中華民國年月 摘要 背景：在台灣，每年平均約有兩千名患者死於心肌梗塞，每年罹患人口據保估計約在九千名以上。冠狀動脈心臟病的病因是由於心臟血液的血管狹窄及阻塞，造成心臟肌肉無法得到足夠氧氣及營養成分，而造成壞死。冠狀動脈繞道手術將讓心肌細胞重得氧氣及營養成分。在此，我們就利用細胞實驗，摸擬心肌細胞心肌細胞缺血缺氧及再灌流的情況，探討心肌細胞成長情況。 材料與方法：培養心肌細胞(H9C2細胞)。給予無血清培養液，培養於無氧環境24小時，再培養於正常情況。收取細胞，觀察細胞型態，計算細胞數，DNA片段化分析，Caspase-3蛋白質分析。 結果：心肌細胞缺血缺氧及再灌流後，細胞型態出現變化，細胞數目大量減少，DNA形成片段化，Caspase-3蛋白質表現量增加。 結論：心肌細胞缺血缺氧及再灌流後，會造成心肌細胞傷害，使到細胞走向細胞凋亡。 目次 摘要i 目次v 圖目錄vi 實驗專題研究報告： 建立心肌細胞缺血缺氧及再灌流導致細胞凋亡模式之功能性評估平台 介紹1 材料與方法2 結果18 結論、討論 參考文獻22 作者簡介23 v 圖目次 圖1 H9C2細胞型態 圖2 血球計數器 圖3 控制組及實驗組細胞型態比較19 圖4 DNA電泳分析結果20 圖5 蛋白質分析結果20 vi 建立心肌細胞缺血缺氧及再灌流 導致細胞凋亡模式之功能性評估平台 冠狀動脈心臟病的病因是由於心臟血液的血管狹窄及阻塞，造成心臟肌肉無法得到足夠氧氣及營養成分，而造成壞死，臨床上稱此種現象為心肌梗塞。【1】現在醫療科技的進步，冠狀動脈繞道手術將冠狀動脈阻塞、狹窄的部份切除，而是將取自身體其他部份”新”的血管連接到阻塞部位更遠端的血管部份，直接”繞”過阻塞，讓心肌細胞重得氧氣及營養成分。【2】 現代生物學將細胞死亡大致分為細胞凋亡和細胞壞死兩大類。細胞凋亡是以細胞核濃縮、染色體DNA被以核小體為單位切成梯狀片段(Ladder)、細胞縮小，最終形成細胞凋亡小體(Apoptotic bodies)等形態變化為特徵。而細胞壞死是以粒線體以及其他細胞器腫大、細胞膨脹、導致細胞膜破裂等形態變化為特徵， 染色體DNA被切成不均等的片段。【3】 Caspase在細胞凋亡的決定階段中扮演重要作用。Caspase-1 (ICE)、Caspase-3 (CPP32)等蛋白水解酶以非活性前體的形式存在，幾處被切斷後轉變成活化型。其在細胞凋亡的決定階段中的作用已經得到證明： A. 在很多種誘導細胞凋亡的過程中，Caspase活性的上升早於細胞凋亡; B. 在細胞內過剩表達時Caspase可誘導細胞凋亡; C. 使用其抑制劑Crm A (Cytokine response modifier A)、p53等可抑制細胞凋亡的發生; D. 利用去除Caspase-1、Caspase-3的小鼠(Knockout mouse)發現正常狀態下誘導出現的細胞凋亡部分被抑制。【4】 因此，利用細胞實驗，摸擬心肌細胞缺血缺氧及再灌流，根據觀察細胞型態，染色體DNA片段化，蛋白質caspase-3表現量，探討心肌細胞成長情況。 材料與方法 (一) 細胞介紹： H9C2細胞 (如圖1) 細胞種類：老鼠心臟肌母細胞 細胞階級：胚胎 組織：心臟；心肌 細胞型態：雙尖紡錘狀 成長特徵：貼附型細胞 適合培養環境：37℃；5% CO2 圖1H9C2於適合的培養環境下之細胞型態。 (二) 細胞繼代培養分盤： 實驗目的： 細胞生長到高密度時，把細胞收集起來，分殖在新的培養盤中，讓細胞有更多而足夠的空間繼續生長。 實驗材料： H9C2 medium，Trypsin，無菌操作台，細胞，細胞培養箱，顯微鏡，水浴槽，pump， PBS，微量吸管，離心機，微量離心管，酒精。 實驗步驟： 1.從冰箱中取出要用到的材料，並利用37℃水浴槽回溫。 2.關閉無菌操作台UV燈，並開啟無菌操作台風扇及日光燈。噴酒精於無菌操作台平面，並擦拭乾淨，以達到消毒效果。 3.將要使用到的物品，噴酒精消毒，並擦拭乾淨，再帶入無菌操作台內