饲料中伏马毒素的测定免疫亲和柱荧光光度法.docVIP

饲料中伏马毒素的测定 免疫亲和柱-荧光光度法 伏马毒素是由串珠镰刀菌等产生的真菌毒素，可导致马产生白脑软化症（ELEM），神经性中毒而呈现意识障碍、失明和运动失调，甚至造成死亡；对猪产生肺水肿综合症（PPE），并可能诱发人类的食道癌等疾病，从而对畜牧业及人类的健康构成威胁。目前已知有7种衍生物。伏马毒素检测方法主要有免疫亲和柱-荧光法、免疫亲和柱-HPLC法、毛细管电泳法、液相/质谱法等。 伏马毒素的免疫亲和柱-荧光法是将样品与提取液混合、均匀、过滤，然后将滤液通过键合有伏马毒素特殊抗体的FumoniTest分离柱。此时，伏马毒素键合在分离柱中的抗体上。用蒸馏水将免疫亲和柱上的杂质除去。用淋洗液通过分离柱，将伏马毒素从抗体上分离下来。最后，将淋洗液注入荧光计进行测定，并可通过高效液相色谱（HPLC）进行准确定量和确认。本文旨在探讨利用免疫亲和柱-荧光法检测饲料中伏马毒素的方法性能。 1材料与方法 1.1 试剂 1.1.1 甲醇：色谱纯。 1.1.2 甲醇+水（8+2）。 1.1.3 氯化钠。 1.1.4 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值到7.0，最后用纯水稀释至1000mL。 1.1.5 吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。 1.1.6 pH7.0磷酸盐缓冲溶液：取25.0mL 0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液与29.1mL 0.1mol/L的氢氧化钠溶液混匀后，稀释到100mL。 1.1.7显色液的制备 将20μL显色液B加入到显色液A中，备好后，置于室温即可。不用时应拧紧瓶塞。该混合液有效期为5天。 直接用移液器及吸头从显色液容器中移取1mL A、B的混合液，切勿用分配器移取。混合液待用时要拧紧瓶塞。 1.1.8 伏马毒素标准品B2。 1.2 设备与材料 1.2.1 高速均质器：18000r/min~22000r/min。 1.2.2 伏马毒素免疫亲和柱（由北京中检维康技术有限公司提供）。 1.2.3 玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm。 1.2.4 玻璃试管：直径12mm，长75mm，无荧光特性。 1.2.5 空气压力泵。 1.2.6 荧光分析仪。 1.2.7 高效液相色谱。 1.3 方法 1.3.1 将伏马毒素B2的标准品配制成溶液后往饲料中添加，分别制成0.8，2.0，3.2，4.0 mg/kg的样品。 1.3.2 样品的提取 将50g研磨的样品+5g 盐+100mL的甲醇：水（80：20）溶液混匀，高速均质1分钟，槽纹滤纸过滤。 1.3.3 稀释、过滤 用40mL的PBS/0.1% Tween-20清洗缓冲液稀释10mL上述提取液，1.0μm微纤维滤过滤。 1.3.4 亲和柱色谱操作 将10mL的稀释提取液通过亲和柱，用10 mL PBS /0.1% Tween-20清洗缓冲液清洗亲和柱；将10 mL的PBS通过亲和柱。用1mL的色谱级甲醇淋洗亲和柱，提取液收集于测试管中。 1.3.5 伏马毒素的测定 向试管中加1.0mL的显色液A和显色液B的混合液，然后插入荧光计，4分钟之后读数。 2 结果与分析 2.1 线性范围（猪配合饲料） 厂家提供伏马毒素测量范围在0~6mg/kg。我们设定0~5 mg/kg范围，测得相关系数为0.9589，与厂家说明基本吻合。 2.2 回收率 表1 伏马毒素B2在猪配合饲料中添加的回收率 添加浓度(mg/kg) 0.8 2 3.2 4 实测浓度(mg/kg) 0.6 2 2.3 4.4 回收率（%） 75 100 71.88 110 测得平均回收率为89.22%。样品的混合均匀程度和蛋白质的污染问题是影响免疫亲和柱-荧光光度法回收率的主要因素。由于各样品中分布的伏马毒素含量不同，甚至同一样品中不同部位的伏马毒素浓度也不一样，因此混合一定要均匀。显色液会腐蚀含蛋白质的物体，所以一定要确保显色液、淋洗液及移液器吸头避免接触含蛋白质的物体（如手指）。饲料样品本身蛋白质含量的高低也会影响免疫亲和柱-荧光光度法的回收率。 2.3 重复性 表2 变异系数 添加浓度 (mg/kg) 重复值 变异系数 CV Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 2 2.1 2.3 2.5 2.2 7.51 4 4.4 5.2 4.3 4.1 10.73 变异系数均小于15%。 2.4 确认试验 串珠镰刀菌在繁殖过程中常会产生多种伏马毒素，有B1、B2、B3；等，都具有较强的毒性。利用上述方法所得的同一个样品提取液，若利用高效液相色谱法测定，既可对伏马毒素B2进行确认，又可对其准确定量，还可同时测出伏马毒素其它组分B