RealTimePCR检测方法原理.doc

Real Time PCR 检测方法原理 ■ 嵌合荧光染料检测法 (SYBR Green I) SYBR? Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与双链DNA非特异性结合，结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中的SYBR? Green I 荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR? Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。具体原理见下图。 嵌合荧光染料法原理图 ■ 双标记荧光探针法 双标记荧光探针法是使用5’端带有荧光物质（如：FAM等)，3’端带有淬灭物质（如:TAMRA等）的双标记荧光探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当双标记荧光探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。 当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在PCR反应的延伸过程中，Taq DNA聚合酶的5’→3’Exonuclease活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。 具体原理见下图。 双标记荧光探针法原理图 ■ CycleavePCR法原理 CycleavePCR法是由RNA和DNA构成的杂合Cycling 探针与RNase H组合使用的高灵敏度检测方法，能够高效率地检出目的基因。Cycling 探针内部夹有RNA部分，一 端标记荧光物质，另一端标记淬灭物质，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光，但当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，RNase H在RNA部分将探针切断，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光，通过测定荧光强度，能够实时监测扩增产物量。 如果探针的RNA部分与模板不匹配，RNase H就不能在RNA部分将探针切断，所以该检出方法是一种即使一碱基不同也能识别的高特异性检出方法，特别适合于SNP解析。Cycling 探针碱基数少，一般为十二个碱基左右，荧光报告基团和淬灭基团的距离近, 淬灭效果好，荧光背景低，信噪比高。 具体原理见下图。 Cycling 探针法原理 ■ 利用CycleavePCR法的SNP解析原理 CycleavePCR法在SNP分型解析方面具有强大的优势。使用CycleavePCR法进行SNP解析，在设计探针时，把多型位点或与其相邻的第2 ~ 3个碱基设计成RNA，使用不同的荧光物质分别标记野生型和突变型探针，通过对两种不同荧光物质进行双通道同步检测，实现对每个检测样品的SNP位点的基因型判定。