显微镜的结构使用及维护与植物制片技术1.pptVIP

显微镜的结构使用与维护及植物制片技术 一、显微镜的结构使用及维护 显微镜的光学原理 显微镜的几个基本概念 显微镜的结构 显微镜的使用 显微镜的维护 要知道的几个重要的分辨率: 显微镜的发展 1.1 人眼：人眼观察物体的能力是有限的。一般的情况下，在25cm的明视距离内，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的两个物体。也就是说，当两个物体相距不到0.1mm的时候，人眼就会把它们看成是一个物体了。这个极限便称为人眼的分辨本领。 1.2 放大镜：约在四百年前眼镜片工匠们开始磨制放大镜。当时的放大镜的放大倍数只有3—5x 1.3 显微镜的发展： 1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者造出类似显微镜的放大仪器。 1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。 1850年出现了偏光显微术； 1893年出现了干涉显微术； 1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术 显微镜的使用 显微镜的几个基本概念： 1、光源：能发射光波的物体。 可见光频率范围：7.5×1014 - 3.9×1014 Hz。 真空中对应的波长范围：390nm – 760nm 相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红 2、 数值孔径 数值孔径又叫镜口率。它是指所观察的物体与镜头间介质的折射率n与物镜镜口角α一半的正弦值的乘积。用N.A或A.来表示。 即：N.A.＝nsin（α/2）所谓镜口角是指被观察点射入物镜前 透镜的边缘光线之间的夹角。数值孔径是物镜与聚光镜的重要参数， 一般希望它越大越好。一是增大镜口角，可以让标本与物体尽量靠近。但无论怎样靠近，α总是小于180°。这样，sin（α/2）也小于１。而空气的折射率n＝1。因此，干燥系物镜的数值孔径nsin（α/2）总是小于1，一般在0.04～0.95之间。二是增大物镜与标本之间的折射率，可在物镜与标本之间加入折射率较大的介质。如香柏油的折射率n＝1.515，使用香柏油为介质时，可使数值孔径达到1.2以上。 物镜数值孔径 3、分辨率  分辨率是指显微镜分辨被检物体细微结构的能力。它与分辨距离成反比。 分辨距离是指能被分辨开的两物点间的最小距离。分辨距离越小，显微镜的分辨率越高。 如果两物点间的距离小于分辨距离，就会把两点误看成一点，无法看清其结构。 显微镜的分辨率是由物镜决定的。目镜只起放大作用，不能增加显微镜的分辨率。 在普通中心照明的情况下，物镜的分辨距离ｄ由下式决定。　ｄ＝0.61*λ/N.A.　式中：ｄ表示分辨距离, 单位是微米，λ表示照明光线的波长，单位也是微米。在可见光中，亮度最大而且对人眼最敏感的波长为0.55μm，物镜最大的N. A.为1.4。代入上式可得ｄ近似为0.2μm。即，使用普通光学显微镜，在中心照明的情况下，分辨距离的极限为0.2μm。也就是说，小于0.2μm的两物体，普通光学显微镜无法区分。 4、 放大率显微镜的放大率等于物镜的放大率和目镜的放大率的乘积。从原理上讲，放大率可以做的非常大。但是，如果标本的细节不能被物镜分辨开来，放大的再大，也毫无意义。理论上可以推导出来，显微镜最合适的放大率（称为有效放大率，用Ｍ有效表示）是在物镜的数值孔径的500～1000倍之间。即　　　　　500N.A.≤Ｍ有效≤1000N.A.在有效放大率范围内，眼睛可以长时间观察而不易疲劳。如果放大率低于500 N.A.，观察起来就很吃力。如果高于1000N.A.，则会使像质变坏，甚至造成不真实的像。因此，超过1000N.A.的放大率称为无效放大率。 5、工作距离  工作距离是指显微镜调焦后，在使用标准盖玻片和标准机械筒长的情况下，物镜的下表面至盖玻片上表面之间的距离。物镜的放大率越高，工作距离越短。一般10倍以下的低倍物镜，工作距离为5～7mm，而100倍的油镜，其工作距离只有0.19mm左右。 6、焦点深度 当显微镜调焦于标本中某一平面后，不仅这一物平面可以看清楚，而且和它相连的上下两个物平面也能同时看清楚。这上下两个物平面之间的距离叫做焦点深度，简称焦深。 显微镜的焦深是很小的，而且数值孔径越大、总放大率越大，焦深越小。 例如，使用N.A.为1.25/100倍的油镜、12.5倍的目镜观察时，焦深只有0.27μm。这就是说，调焦后一次只看清楚0.27μm厚的一个薄层。而普通标本一般都有几个微米厚。要想看完整个标本，需要使用显微镜的微调机构，自上而下分层观察。 焦点深度 7、视场 视场又叫视野。是指显微镜一次