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反向遗传在负链RNA病毒中的应用 反向遗传在负链RNA病毒中的应用 一、反向遗传在RNA病毒中概述 二、反向遗传在负链 RNA病毒中的应用 三、反向遗传引起的思考 反向遗传在负链RNA病毒中的应用 一、反向遗传在RNA病毒中概述 (一)概念 (二)研究背景介绍 1.研究进展 2.DNA病毒反向遗传操作 3.正链RNA病毒的反向遗传操作 4.负链RNA病毒的反向遗传操作 一、反向遗传在RNA病毒中概述 (一)概念： 经典遗传学(正向遗传学)：表型→基因 经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。 反向遗传学：基因→表型 反向遗传学指直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象。 (一)概念 RNA病毒的反向遗传操作： 指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆,在病毒cDNA 分子水平上对其进行体外人工操作,如进行基因点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造,以此来研究RNA 病毒的基因复制与表达调控机理、RNA 编辑和自发重组与诱导重组、病毒与宿主间的相互作用关系、抗病毒策略、基因治疗研究,以及构建新型病毒载体来表达外源基因和进行疫苗的研制。 (二)研究背景介绍 1.研究进展： Qβ噬菌体是第一个在基因水平上进行遗传修饰的RNA 病 毒 。首先成功拯救出有感染性的病毒是单分子不分节段负链 RNA 病毒目中的狂犬病病毒 ，随后,其它一些不分节段的负链 RNA 病毒也相继用感染性cDNA克隆技术获得成功,包括水泡性 口炎病毒、麻疹病毒、仙台病毒、呼吸道合胞体病毒、人副粘 病毒3 型、传染性猴病毒5 型、新城疫病毒和犬瘟热病毒等。 长达27kb 的猪传染性胃肠炎病毒( TGEV) RNA 得以克隆是现 今克隆的最长的cDNA 。流感病毒是反向遗传技术应用于负链 分节段RNA病毒的成功范例。 (二)研究背景介绍 2.DNA病毒反向遗传操作： 在DNA病毒、正链RNA病毒和负链RNA病毒中，对于DNA病毒进行的基因操作困难最小，因此最先开始进行。 策略：使用编码病毒基因组的质粒转染细胞，亦或通过对携带病毒基因组序列的质粒之间进行异源重组来得以实现。 (二)研究背景介绍 3.正链RNA病毒的反向遗传操作： 由于病毒基因组即是mRNA，并具有感染性，因此简单地将含有病毒基因组的质粒或从质粒体外转录来的RNA转染敏感细胞，便可获得完整的有感染性的病毒。 虽然通常认为获得感染性克隆需全长病毒序列,但病毒不完全cDNA 克隆也会产生感染性转本。 (二)研究背景介绍 4.负链RNA病毒的反向遗传操作： 负链RNA病毒基因组进行人工操作较正链RNA病毒困难 ： 负链RNA 病毒裸露的基因组RNA 或由cDNA 克隆转录的RNA本身没有感染性,因为负链RNA 病毒的复制需要病毒核蛋白和聚合酶，才能表达和包装出活病毒。 反向遗传在负链RNA病毒中的应用 二、反向遗传在负链 RNA病毒中的应用 (一)、流感病毒的反向遗传操作 (二)、反向遗传操作在鸡新城疫病毒的应用 (三)、反向遗传操作在其它负链RNA病毒的应用 反向遗传操作在布尼亚病毒应用 反向遗传操作在狂犬病毒的应用 反向遗传操作在埃博拉病毒应用 二、反向遗传在负链 RNA病毒中的应用 完整的负链RNA病毒主要跨越了六个病毒科：未分节段的杆状病毒科、负粘病毒科、丝状病毒科及分节段的正粘病毒科（8节段）、布尼亚病毒科（3节段）、沙拉病毒 科（2节段）。 目前已在流感病毒、鸡新城疫病毒、布尼亚病毒、埃博拉病毒、狂犬病病毒上成功拯救! 二、反向遗传在负链 RNA病毒中的应用 (一)、流感病毒的反向遗传操作： 1.流感病毒的基因组结构： 流感病毒属单股负链RNA病毒，由大小不等的8个独立片段组成。这8个基因片段编码10个基因产物，其中片段1-3分别编码PB2、PB1、PA聚合酶，片段4和片段6分别编码血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，片段5编码核蛋白(NP)，片段7编码病毒基质蛋白Ml和离子通道蛋白M2，片段8编码非结构蛋白NS1, NS2。 PB1、PB2和PB3与NP蛋白和病毒RNA相连接