2010核酸体外扩增2.pptVIP

核酸的体外扩增 广州医学院实验医学研究中心 刘启才 E-mail：liuqicai968@ Tel :聚合酶链反应 （PCR , Polymerase Chain Reaction） PCR是试管内进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，体系一般含有DNA模板,耐热的Taq DNA聚合酶，寡核苷酸引物，4种dNTP 及合适的缓冲液。 （一）PCR的原理 PCR(Polymerase Chain Reaction)是在试管内把模板DNA与特异引物，四种脱氧核苷酸 （ dNTPs, dATP、dGTP、dCTP、dTTP、）混合，再加耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）产生酶促反应。 包括三个主要的步骤：高温变性（denaturation，94℃），通过加热使模板DNA双螺旋的氢键断裂，解链成单链DNA；低温退火（anealing　55℃），反应混合物降温，引物与单链DNA模板的互补序列结合，形成模板-引物复合物；中温延伸（extension 70℃左右），将反应混合物升温，在Taq DNA聚合酶作用下，以碱基互补的原则合成一条新的DNA单链. 这三个步骤要重复30-40次 （二）PCR反应体系的组成成分 Taq DNA聚合酶 模板DNA 引物 dNTPs Mg2+ 反应缓冲液 一、PCR反应的酶及浓度 1-2.5 Units/100μl 反应体系（试验浓度0.5-5u ） 浓度太高，保存的甘油会影响Taq DNA聚合酶的活性，引起非特异产物的扩增，并产生背景。 浓度过低则合成产物量减少。浓度太低，反应产物量很少。 制造条件以及对活性定义不同，Taq DNA聚合酶的用量有所不同。 扩增片段的长短及其复杂程度（G+C含量）不同而有所区别。 不同公司的Taq DNA聚合酶要使用配套的酶缓冲液。 Ex Taq , LA Taq, rTaq hotstart Taq , pfu, prime star 二、模板DNA PCR的膜板可以是DNA，也可以是RNA 以RNA作为模板时，首先要进行逆转录生成cDNA,再进行常规的PCR反应。 常见的模板来源： 1. 病原体标本 2.病理生理标本 ：组织、细胞，尿液，绒毛 3. 法医学标本: 血斑、精斑和头发等 三、dNTPs浓度 dNTPs保存在pH7.8~8.0溶液中。酸性环境会使dNTP分解成dNDP、dNMP 4种dNTP在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。 在PCR反应中，dNTPs浓度应在20~200 μM，浓度过高会抑制PCR反应，同时还可增加碱基的错误掺入率。 低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但能减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，可提高实验的精确性。 决定最低dNTP浓度是靶序列的长度和组成。（100μl 20 μM dNTP s 可以合成2.6 μg DNA或10pmol 400bp的序列。） dNTP与MgCl2的浓度之间的关系成正相关 四、PCR反应中的引物浓度 一般为100~500nM， 适当增加引物能增加产物量，但引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的率，两者还由于竞争用酶、dNTPs，均会使DNA合成率下降。 五、PCR反应引物设计 引物决定PCR扩增产物特异性和长度，引物的设计与PCR反应的成败关系密切 PCR引物设计的目的: 是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。 引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在。（一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补 ） 5’--------------GTGC 3’ 3’ CAGC------------5’ 5’--------------GTGC ------------ -------------CAGC-------------5 5 ’----GATCCACA---TGTGGATC---3 5 ’----GATCCACA ----CTAGGTGT 两个引物应有相近的Tm值，若相差太远，可把低Tm值的引物延长。 引物3’末端碱基： ①原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。 ②3′端绝对不能进行任何修饰。 　③引物3’末端碱基在错误配对时不同碱基引发的效率存在很大差异。 当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链的合成，而末位碱基为T时，错配时引发合成的效率大大