微生物限度方法学验证材料.docVIP

微生物限度检查 方法学验证 一、检验方法 依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。 二、菌种、培养基及稀释液 表1菌种 菌种名称 菌种代数 菌种状态 厂家 大肠埃希菌 [CMCC(B)44102] 3 正常 浙江省食品药品检验研究院 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003] 3 正常 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501] 3 正常 白色念珠菌[CMCC(F)98001] 3 正常 黑曲霉[CMCC(F)98003] 3 正常 乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B)50094] 3 正常 表2培养基 培养基名称 批号 厂家 营养肉汤培养基 150222 北京三药科技开发公司 改良马丁培养基 150134 北京三药科技开发公司 改良马丁琼脂培养基 150215 北京三药科技开发公司 营养琼脂培养基 150317 北京三药科技开发公司 玫瑰红钠琼脂培养基 150323 北京三药科技开发公司 胆盐乳糖培养基 150127 北京三药科技开发公司 胆盐硫乳琼脂培养基 150214 北京三药科技开发公司 四硫磺酸钠亮绿培养基 150416 北京三药科技开发公司 MUG培养基 150122 北京三药科技开发公司 曙红亚甲蓝琼脂培养基 150137 北京三药科技开发公司 三糖铁琼脂培养基 150207 北京三药科技开发公司 表3对照用培养基 对照培养基名称 批号 厂家 营养肉汤对照培养基 135004-201103 中国食品药品检定研究院 营养琼脂对照培养基 135003-201002 中国食品药品检定研究院 玫瑰红钠琼脂对照培养基 135005-201002 中国食品药品检定研究院 胆盐乳糖对照培养基 135006-201404 中国食品药品检定研究院 胆盐硫乳琼脂对照培养基 135010-201102 中国食品药品检定研究院 四硫磺酸钠亮绿对照培养基 135020-201101 中国食品药品检定研究院 MUG对照培养基 135012-201001 中国食品药品检定研究院 曙红亚甲蓝琼脂对照培养基 135009-201102 中国食品药品检定研究院 三糖铁琼脂对照培养基 表4试剂 试剂名称 批号 级别 磷酸二氢钾 130826 分析纯 氢氧化钠分析纯 氯化钠分析纯 聚山梨酯80化学纯 95%乙醇药用级 二甲氨基苯甲醛分析纯 盐酸分析纯 稀释液：pH6.8缓冲液0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。 （3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液无菌氯化钠溶液菌液的制备 24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 2控制菌 接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 四、验证内容 1、计数方法验证 将制备好的菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液以每10倍体积分别稀释成一系列浓度菌悬液，利用血球计数板计数，确定具体菌悬液浓度，取接近于10cfu-100cfu的稀释浓度，选取各项试验项下的规定浓度进行实验。稀释及观察均应在阳性室内完成。 经过验证当原液稀释至10-6时，菌液浓度接近100cfu/ml。 2、适用性检查 2.1细菌、霉菌、酵母菌 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml(内含菌约50～100cfu)，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50～100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾