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全血DNA的提取及电泳 晁耐霞 2012.03.09 1.实 验 原 理 DNA 由于血液各组分成分颗粒大小及比重不同，利用明胶的吸附作用，使红细胞沉积在管底，从而与白细胞相分离。 通过SDS的破膜（细胞膜和核膜）作用，使白细胞释放出DNA。 然后利用酚和氯仿抽提纯化，分离去除蛋白质。 最后用乙醇沉淀洗出DNA。 2.材料与方法 ⑴.材料 用含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有EDTA和肝素，EDTA更好一些，不会影响下游的反应。 每5ml的血液中加入0.4ml 0.04M EDTA配好的EDTA溶液，颠倒混匀即可。 保存于-20℃至-80℃，最好在2个月内提取。 3%明胶，TES， Tris饱和酚（pH7.8），氯仿：异戊醇（24:1），无水乙醇，TE 离心机，7ml离心管，1.5mlEP管，中试管，移液器 ⑵方法： Ⅱ 破碎WBC Ⅲ 抽提DNA 二、琼脂糖凝胶电泳 ⑴琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定以及纯化DNA或者RNA分子的方法。 ⑵这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 ⑶电泳介质 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，是由D型和L型半乳糖以α-1，3和β-1，4糖苷键相连形成的线状高聚物。沸水中溶解，45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小（孔径范围从50nm到大于200nm）决定于琼脂糖的浓度。 ⑷.DNA分子的电荷效应： DNA在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。 DNA带净电荷量的多少与电流强度，电泳缓冲液的pH值和离子强度有关。 ⑸. DNA琼脂糖电泳的分子筛效应： 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小、构型和琼脂糖的浓度是主要的影响因素。 ③琼脂糖的浓度 ② 分子量标准参照物（Marker） 3. 实验材料和试剂 ⑴实验材料： 全血基因组总DNA ⑵.实验试剂： 琼脂糖 5×TAE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液（ 6× loading dye）： 0.25％ 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 goldview I型核酸染料： 每10 μl DNA加入2 μl染料。 4. 操作步骤 ⑴.制胶 1.0% 琼脂糖凝胶，0.5×TBE ⑵.上样 上样缓冲液 ⑶.电泳 100V，20min ⑷.观察 紫外灯下观察 溶 胶 上样准备 凝胶冷却至50℃，加goldview I 2 μl摇匀 凝胶凝固后取出梳子 加缓冲液 准备样品 点 样 电 泳 注意观察溴酚蓝染液的迁移 紫外灯下观察电泳结果 照 相 * * 一、全血DNA的提取 Ⅰ 提取WBC 取1ml 全血 等体积3%明胶 37℃静置，5·10min 取上清 3000r/min 离心 ，5min 弃上清 颠倒混匀 溶液颜色均一 溶液颜色 上下分层 沉淀颜色为 红色 加入2ml TES 加10滴10%SDS 轻轻敲击管底震荡混匀 颠倒混匀 溶液全部变为 粉红色 溶液颜色变暗 加等体积 Tris饱和酚 颠倒混匀，50次， 4000rpm，离心5min 取下层酚溶液，混匀后溶液变为均一的棕色 取上清 加等体积氯仿：异戊醇（24:1） 将上清移入试管 颠倒混匀，50次 4000rpm，离心5min 混匀后溶液变为均一的乳白色 上清夜（DNA） 蛋白质层 酚溶液 上清夜（DNA） 蛋白质层 氯仿溶液 Ⅳ 沉淀DNA 加2.5倍 无水乙醇 吸出絮状沉淀到1.5mlEP管 挥干至 无色液体 通风橱内放置5min 加入100μ? ddH2O溶解 缓慢加入后，上下均为无色，但有分层面；吸取上层乙醇，轻轻吹打下层（油状）混匀。 无水乙醇与水溶液交界面特点： 1.气泡 2.白色絮状沉淀 1.原理 ①DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。 M 1 2 3 4 5 ② ①示踪染料： 有致癌性: EB，吖啶橙等; 无毒的染料：goldview I核酸染料等 ⑹.示踪染料和分子量标准参照物 EB goldview ⑶.实验仪器 凝胶成像系统 DNA: 8μl 6×loading dye: 2μl Total : 10μl 分别吸取上述体积的DNA和6×loading dye，至透明胶布的光滑表面，用移液器吹打均一。 *