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色谱柱培训 前言 色谱柱是HPLC分离过程中的核心。一支稳定、高效的色谱柱对建立普适性强、重现性好的方法是必不可少的。不同供应商的色谱柱，甚至来源相同，认为完全一样的色谱柱之间，可能存在很大的差异，尤其是不同色谱柱在塔板数、色谱峰的对称性、保留值、峰间距及使用寿命会有所不同，而这些不同对建立理想的HPLC方法会产生很大的影响 培训内容 介绍色谱柱担体、固定相以及柱填料信息 讨论色谱柱使用过程中的问题及适宜的解决方案 同时讨论在常规HPLC分析中，为获得最佳结果，一支“好”色谱柱的重要意义 色谱柱的结构 色谱柱与柱填料的特性 柱填料：大多数使用HPLC分离的色谱柱使用硅胶微粒作为担体。少数为多孔聚合物担体或者其他材料的担体 硅胶担体与键合的有机表层应用范围广，重点讨论 常见的几种柱填料微粒：实心微球、全多孔微球、灌注微粒 实心微球型特点：实心核、起作用的是表面很薄的外壳、微粒的大小通常为1.5~2.5um，快速传质的动力学，对大分子有突出的分离效能；表面积较小，样品容量有限，仅适用于分析型HPLC；峰型尖锐，要求HPLC仪器的柱外峰展因素极小，避免峰展宽 灌注色谱柱填料：包含孔径达4000~8000?的贯穿孔，贯穿孔中有较小的内联孔（如300~1000?）；高流速时，对流与扩散作用共同作用，进入并离开孔结构，减小了峰展宽，柱效与小微粒相当，但压力降却小许多。 使用范围：大分子如蛋白质的制备分离，小分子较少 插入色谱柱的参数意义：ID4.6mm 颗粒（粒度）的大小在HPLC中极为重要。约5um的微粒直径很好的兼顾了分析柱的柱效、反压和寿命。更小的多孔微粒（如3um）对快速分离很有效。 较窄的粒度分布（＜±50%均值）能保证填充柱的稳定、高效和压力降最小 硅胶填充微粒 物理特性：机械强度很高，可保证填充柱长时间在很高的操作压力下工作，柱效稳定；使柱的反压较低，寿命较长。 制作工艺：良好的控制制作工艺，能够得到平均孔径变化范围宽（如8、30、100um）、孔径分布范围较窄和粒度选择较大（如10、5、3um）的填料。能满足大、小分子的分析和制备 硅胶担体的表面性质极为理想，其表面可以通过化学改性引入种类繁多、具有不同官能团的键合相 硅胶基质填料与水及所有有机溶剂兼容，更换溶剂时，填料大小不会变化（例如溶胀）。这种特性使填充床在用各种类型溶剂时以及使用梯度洗脱期间，仍保持稳定 硅胶担体并非完美无缺：在pH8.0以上条件下，硅胶能溶解；硅胶表面显酸性，不适宜于碱性物质的分离 插入硅胶溶解曲线 硅羟基一般存在三种类型 自由或孤立（无氢键键合）的硅羟基一般产生于低浓度中。含自由、酸性硅羟基浓度高的硅胶往往使碱性物质的保留值增加，峰变宽、拖尾。 完全羟基化的硅胶基质填料，具有高浓度成对的与缔合的硅羟基，最有利于碱性物质分离。（查成对硅羟基的酸性） 硅胶担体的纯度对许多极性化合物的分离极为重要。某些硅胶被一定的金属污染（Al、Fe、Zn、Ni等） 这些金属杂质能与螯合溶质络合，引起不对称、拖尾色谱峰，甚至化合物被完全保留，不能洗出 硅胶晶格中的其他金属（尤其是铝）能使表面硅胶硅羟基活性增强，酸性增强 建议：采用色谱级试剂！！ 硅胶分类 A型硅胶：过去纯度不高的硅胶，适用于分离中性和非电离的化合物 B型硅胶：新型高纯度的弱酸性硅胶，一般对离子或可电离的化合物，尤其是碱性物质的分离较好 B型硅胶的意义：见FDA批准的化药碱性药物表 多孔聚合物填料 优点：聚合物微粒有些是疏水性的，可直接用于反相，不需添加表面涂层；在pH1~13均可用；很强的疏水保留性（相对于硅胶基质的C18柱） 缺点：柱效低，一般不到类似的硅胶基质色谱柱的一半；在不同有机溶剂中溶胀程度不同。 使用范围：非常适用于蛋白样品的分离 其他无机填料 石墨碳 氧化铝 色谱柱的结构 不锈钢柱管：可用于所有的有机溶剂与大多数水性缓冲液，然而含氯的流动相会缓慢地“卤素腐蚀”不锈钢柱管，尤其是低pH条件下 柱管不锈钢成分（铁、镍、铬）牢固络合的样品可能发生这类问题，但因为色谱柱内壁的表面积很小，发生不良反应的机会不大 多孔烧结物（滤片）：封闭色谱柱的两端，固体色谱柱的填料 一般来说，5um与3um的微粒分别用2um与0.5um孔径的不锈钢滤片 发生不良反应的可能比色谱柱内壁大得多 峰型不好与样品回收率低可能预示滤片出现问题 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。 密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。 接头：柱两端连接流动相与柱管的中空环套，由不锈钢制成。用于柱管路联通与柱端高压固定。 封头：柱两端的密封螺丝，用于保存色谱柱时封头。 柱填料 固定相 键合硅胶：在硅胶担体表面上