组织切片技术.docVIP

组织切片技术 组织制片概述 组织制片技术是观察细胞、组织的生理和病理形态变化的一种主要的方法。组织化学技术和原位杂交技术都是以组织制片为基础的。 一、制片前的准备工作 1.染色缸和标本瓶的清洗 用毛刷沾去污粉将染色缸和标本瓶里外擦洗，自来水冲洗干净备用。金属银或组织化学染色时，器皿更要彻底清洗。先去污粉洗，再洗液浸泡过夜，再自来水和蒸馏水冲洗。 洗涤液的配制：重铬酸钾 300克 浓硫酸 300毫升 蒸馏水 3000毫升 2.载玻片和盖玻片及其清洗 载玻片简称为玻片或载片，一般尺寸为76毫米×26毫米，厚度为1-1.5毫米。 盖玻片一般为正方形或长方形，厚度为0.15-0.5毫米。最常用的规格为18×18毫米、20×20毫米，还有其它规格的。 煮沸洗涤法: 新旧玻片均可采用。洗衣粉水浸没玻片，加热煮沸15-20分钟，冷却，自来水冲洗，干净的白棉布或纱布擦干，保存备用。 酒精浸泡擦拭：新的玻片或载片可直接用酒精浸泡、擦拭，保存备用。 洗液浸泡法：要求严格的玻片，可在洗液浸泡后在冲洗干净。 二、制片方法的种类 （一）非切片法 不用切片机、没有切片手续而制成切片的方法。常用的有以下几种： 1.整体封藏法 待制作的材料一般很小或为一薄片状，如无脊椎动物的水螅和草履虫等，脊椎动物的鸡胚和蛙胚等。这些材料取下后经固定、脱水和染色就可以封藏在玻片内。 2.涂片法 主要是液体或半流动性的材料，如血液、精液、细胞学检查、微生物等，直接将材料涂在玻片上，再经固定和染色制成标本。 血液涂片的制作与染色：取一干净载玻片，用左手拇指和食指夹住，然后取一小滴动物血置于载玻片右端,再取另一张边缘光滑的载玻片, 斜置于血滴左侧, 先向右稍移动轻轻触及血滴,使血液沿玻片端展开成线状, 两玻片的角度以30~40°为宜(角度过大血膜较厚,角度小则血膜薄), 轻轻将载玻片向左推进,即涂成血液薄膜,推进时速度要一致,否则血膜成波浪形,厚薄不匀. 待涂片在空气中完全干燥后,将血涂片靠近中央部分的两边(与载玻片短边平行的边)用玻璃铅笔圈上并平放在染色架上进行染色。①滴加数滴瑞特氏-姬姆萨(Wright’s-Giemse)混合染液覆盖已圈血膜，同时记住滴数，染3-5分钟。②滴加等量的蒸馏水后稍加晃动玻片继续染色5-10分钟。③用蒸馏水或自来水冲去染液(注意还要直接冲洗已圈部位), 吸水纸吸干或凉干即可观察。 3.撕片法 疏松结缔组织和肠系膜等就是采用这种方法。 4.磨片法 主要用于含钙盐较多的坚硬的材料，如脊椎动物的牙齿和骨。 5.撕碎法 6.压碎法 7.印片或触片法 （二）切片法 使用切片机切片而制成切片的方法。常用的有以下几种：.石蜡切片法、冰冻切片法、振动切片法、超薄切片法 石蜡切片技术 第一节 取材和固定 制作切片的第一步就是把动物杀死，取下需要制作切片的材料。动物杀死的方法很多。根据动物的大小、种类及观察目的而定。例如，青蛙和小鼠等较小的动物可用断头法。一些较大的动物如兔子和猫等可用空气栓塞法，从耳静脉注射入空气，使动物心脏发生急性空气栓塞，循环障碍，痉挛而死。此种方法各脏器易瘀血。也可采用扑杀法。无论那种方法都应该使动物迅速死亡。 动物杀死后立即取材和固定，否则组织会因失水变形和发生死后变化。 一、取材 1.动物屠宰前应写好程序，准备好刀子、剪子、镊子、线、注射器、生理盐水、固定液等。固定液的量一般为材料的10---15倍或稍多。 2.取材注意事项 取材的刀、剪要锋利；动作要轻，不可来回切割，不要挤压组织以免损伤内部，先用镊子轻轻夹住，再用剪子或刀子切下，被镊子夹过的部分不要；柔软的组织可取稍大些，固定数小时后再切成小的组织块，继续固定；取材要快；切取的材料应根据需要观察的部位进行选择，考虑好切面的方向。 3.取材的顺序 先取容易自溶的组织，骨骼和肌肉后取，依次为心脏、肺、肝、脾、肾、小、大肠、肾上腺、睾丸、卵巢、子宫、脑垂体等。 取肠时可用生理盐水轻轻冲洗肠内容物，然后结扎一端，注入固定液，再结扎另一端，固定3—4小时后再切成小段。肺脏可用少量固定液自气管或支气管注入，约20分钟后略膨胀再切成薄片固定。 4.取材的大小 取材的大小一般为0.5×0.5×0.3厘米，1×1×0.3厘米，最厚不超过0.5厘米。 取材很关键，应新鲜、迅速。 二、固定 将取下的材料，立即投入固定剂内，借助药品的作用，使组织细胞的形态结构保存起来。 （一）固定的目的 1.防止组织的溶解和腐败。 2.使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶类等各种物质沉淀下来，保存组织细胞原有的结构。 3.固定剂兼有硬化作用，使组织硬化、增加硬度，使组织不易变形，有利于以后的处理。 （二）固定剂的种类 种类很多，一般分为单纯固定剂和混合固定剂。单纯固定剂是用一种药品作