血小板活化与流式细胞仪分析.pptVIP

血小板活化与流式细胞仪分析 血小板活化 使用流式细胞仪，同时分析血小板多个活化指标，灵敏、特异地检测全血中的血小板，了解血小板的反应性和活化进程 血小板表面膜糖蛋白（GP）：PAC-1 颗粒膜GP的表达量变化：CD62P 直接使用全血，样本更接近生理状况 操作步骤简便、用血量少、避免体外活化与血小板亚群丢失 血小板减少患者也能精确分析 血小板活化的三色荧光分析 使用PerCP标记的泛血小板抗体CD61，特异地测血小板表面的活化指标，避免碎片等非特异干扰 选择活化血小板特异的表面标记PAC-1，CD62P，检测血小板活化的不同阶段 PAC-1 FITC：IgM型抗体，是血小板活化的早期标志，即活化的血小板膜糖蛋白复合物。 CD62P PE： IgG1型抗体，是血小板活化后颗粒释放的标志 标本采集 枸橼酸钠抗凝采血管顺序编号 抽取静脉血，前2ml弃去不用 抗凝管中注入2ml静脉血，轻轻混匀 10分钟内完成血小板的激活和染色操作 操作过程中注意减少人工激活血小板 为评估血小板活化试验的有效性，采用正常人标本做平行阴性对照，正常人ADP激活标本做平行阳性对照 血小板体外活化 血小板激活剂：ADP，活化终浓度0.2uM 试管内加入50ulADP，450ul抗凝全血 轻轻混匀 37?C温育5分钟 立即进行染色 荧光染色 Falcon管顺序编号，阴性对照为正常人未活化标本，阳性对照为正常人活化标本 每一标本作2管：对照管和试验管 加入相应BDIS抗体及对照各10ul BDIS抗体 FITC PE PerCP 对照管 PAC-1+RGDS IgG1 CD61 试验管 PAC-1 CD62P CD61 荧光染色 对照管和实验管中各加入血标本5ul 轻轻混匀，室温暗处孵育20分钟 各管中分别加入2-8 ?C 1%多聚甲醛1ml，充分混匀，于2-8 ?C暗处固定10分钟 24小时内上机，获取数据，分析结果 流式细胞仪测定 检查鞘液筒和废液筒，打开流式细胞仪 做FACSComp，校正仪器 打开CELLQuest软件，顺序摆放试验管 调出获取条件，FSC和SSC选择Log模式，FSC-SSC点图中出现血小板细胞群 FL3设阈值，获取条件为CD61阳性 在FL1-FL2点图中，对照管目标细胞群位于左下脚 获取对照管及试验管的数据 流式细胞仪分析 CD61 vs SSC点图中设门，找到CD61阳性的血小板群 门内做PAC-1 vs CD62P点图，进行双参数分析 结果统计：PAC-1+，PAC-1+CD62+，CD62+ %PLT 流式细胞仪测定 注意事项 使用枸橼酸钠抗凝 采血时使用大号针管，抽出的前2ml血应弃去不用 尽量避免标本受到物理震荡，减少人工激活 取血后10分钟内进行染色操作 加样时，不要将标本残留在Falcon管壁上 临床意义 直接测量循环血小板活化状态与反应性 可测定凝血酶等诱导剂活化的血小板，即通过血小板体外活化，评估病人血小板的活化能力 血小板活化与临床的关系：监测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成 临床意义 心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关 预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性 缺血性脑血管病与血小板活化有关 子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加 抗血小板治疗疗效监测 总结 使用BDIS三色荧光流式细胞仪分析方法检测血小板活化 同时分析血小板的多种表面标志 流式细胞仪分析，高度灵敏 使用全血分析，标本用量少 操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低 上一页 下一页 返回 PLT activation 研究生免疫学POWERPOINT讲稿 流式专题 制作：姚新生 审校：孙万邦 联系：yxspah@;0852-8204419 8562206 * 上一页 下一页 返回 PLT activation 研究生免疫学POWERPOINT讲稿 流式专题 制作：姚新生 审校：孙万邦 联系：yxspah@;0852-8204419 8562206