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实验一、纤维素酶活力测定及酶促动力学研究 一、原理: 酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应时，其K m值也不同，K m值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，K m值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；K m值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶催化的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。 酶活力可以被某些物质改变，凡能降低酶的活力甚至使酶失活的物质，均称为抑制剂，分为可逆抑制和不可逆抑制两种类型。可逆抑制包括竞争性抑制、非竞争性抑制等类型。在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质会发生改变，如K m，Vmax等，可通过作图法求得，作图法很多，最常用的就是Lineweaver-Burk作图法（即双倒数作图法）。 二、仪器和试剂 1、仪器: (1)恒温水浴锅 （2）电炉 （3）722分光光度计 （4）试管、移液管若干 2、试剂: （1） DNS溶液 (结晶酚、氢氧化钠、亚硫酸氢钠、酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸) （2）2.5mmol/L葡萄糖溶液 （3）0.5%羧甲基纤维素钠溶液 （4）1mg/ml纤维素酶溶液 （5）磷酸缓冲液pH5.8 （6）8mol/lL脲（mL） （7）蒸馏水 三、操作步骤1、标准曲线绘制: 用浓度为2.5mmol/L的葡萄糖溶液配制终浓度分别为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25（mmol/L）葡萄糖溶液进行实验。取试管编号，按下表加样。 试剂 管号 加入顺序 0 1 2 3 4 5 0.2mol/L磷酸缓冲液（mL） 每管加入1ml 加入葡萄糖溶液的量（mL） 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 各种葡萄糖溶液浓度（mmol/L） 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 各种葡萄糖溶液加量 每管加入0.1ml (0号管加水) DNS试剂（mL） 每管加入3.0ml 置沸水浴15min，冷却后定容到10ml 加水定容（mL） 6 5.8 5.6 5.4 5.2 5.0 A550 ? 以葡萄糖的浓度（最终浓度）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。 注意：此标准曲线在后续实验中会用到，请大家将此次绘制的标准曲线保留，今后不再重复绘制。 2、时间作用曲线: 取试管编号，按下表加样。 管号 加入顺序 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0.2mol/L磷酸缓冲液（mL） 每管加入1ml 0.5%底物溶液（mL） 每管加入1ml 酶液（mL） 每管加入0.2ml (0号管为灭活的酶) 保温时间（min）（35℃） 2 2 4 8 10 12 15 20 25 DNS试剂（mL） 每管加入3.0ml 置沸水浴15min，冷却后定容到10ml 550nm测分光光度值 ? 以时间为横坐标，还原糖的量（μmol）为纵坐标，作出时间作用曲线。 注意：设置0号管为对照组，所加酶液是经高温灭活处理的，该组保温时间可随意设定，加样顺序与其它各组相同。 3、底物浓度的影响: 取试管编号，按下表加样。 试剂 管号 加入顺序 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0.2mol/L磷酸缓冲液（mL） 每管加入1ml 0.5%底物溶液（mL） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 酶液（mL） 每管加入0.2ml (0号管为灭活的酶) 保温时间（min）（3