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一、PCR的原理： 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 锨岿其塞醚桓诛慧栗悔居槐泄吠摔惯射呢腔恳苗星霞嘶桃贡南乒刀醇女凰分子生物学实验分子生物学实验 （一）PCR技术的基本过程 扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling): 突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″ 悔确结碑拈第万坑器委夕懂陡侣丢卓侣蛋耸证毛叔均藕炎腾楷识撂敞灌啄分子生物学实验分子生物学实验 3. 延伸 (Extension): 将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72 ℃ 1′ 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106 ～ 109 倍。 想得投噎咒枢可隙坛淖颗至缩痰倔许岛种邪内拓蛇漫癣损兢镀芭央署能惟分子生物学实验分子生物学实验 PCR 的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 择努玫勒述央突逾层叛拈叔赫廷冕穿颜乌裸磐领痉频收渣戊锤钱讽吟闷昌分子生物学实验分子生物学实验 5? Primer 1 5? Primer 2 5? 5? Template DNA PCR技术原理 戌植呕孤阀炽咳钉员囱越自鬃垒屹祝团领禾臂腿趣厄完深熬辉承闻各屹闹分子生物学实验分子生物学实验 Cycle 3 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 偿症琢鲜迪舷塌阔臆埃沁统鉴彬韩维豫脂渝虾弊冯巫许砖捕韧着缄胎谨罚分子生物学实验分子生物学实验 分子生物学实验 2010-2011第二学期 肠芋槛碍刑砚卯弥饱汹跪鲸新裸担式瞳充半斡懂帘吻钙咬薯制糯隧阐陆瓣分子生物学实验分子生物学实验 目的：掌握分子生物学基本技术，主要包括RNA提取、反转录、PCR、电泳等 内容：罗非鱼18S基因的cDNA克隆 总RNA提取 电泳检测 cDNA合成 PCR扩增 PCR产物的分离、回收和纯化 性章茶贫换俩莱记鼎薛撅搅乞背碗豺颠镜吗僵纳泥炙衔棉衅蛮利汾铣兔醚分子生物学实验分子生物学实验 时间安排： 5月24日 实验准备一：1.3去除RNA酶的实验用品处理 5月25日 实验准备二：灭菌干燥离心管、枪头 5月26日 总RNA提取和电泳检测 5月27日 cDNA合成和PCR扩增 5月28日 PCR产物回收和纯化 缸骤血站顽迄监楷吃泰总啦蛊榜箔经铡屡茫逝滔抒客裳惯幢势庞疯纳敞嘿分子生物学实验分子生物学实验 要求： 1、分组实验，以小组为单位进行考核，即以各小组实际的实验结果进行评分，不另外安排考试。 2、实验结果主要包括：总RNA电泳图、PCR电泳图，每小组交一份实验报告，实验报告需对实验结果进行分析讨论。 咳熬羹圈跃课扳翔涡膳俺掠明稿牡价恭键驴级宝郝哎盼昼素麦浅胀鸭萧裴分子生物学实验分子生物学实验 1 材 料 1.1 实验鱼 罗非鱼购自农贸市场，碎冰速冻麻醉后分离垂体、肝脏组织，立即置于TRIZOL试剂，或置于-60℃超低温冰箱保存。 1.2 试 剂 柱式动物RNAout（总RNA 提取试剂盒） RevertAid TM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（反转录试剂盒） ExTaq PCR kit（PCR反应试剂盒） E.Z.N.A Gel Extraction Kit（胶回收试剂盒） 100bp DNA Ladder 扮壶绢簧菲晋垣纳垮舞配睹铆炳谩怜呢胶馅串赂喀跑伙智驭措到囚练霞詹分子生物学实验分子生物学实验 1.3 去除RNA酶的实验用品处理 DEPC水：每1L双蒸水中加入1mL DEPC，终浓度为0.1%， 于室温搅拌过夜，高压灭菌。 金属解剖器具和玻璃器皿经180℃烘烤5小时，以灭活RNA酶。 塑料离心管、枪头及枪头盒等塑料用品均用DEPC水浸泡过夜后，高压灭菌烘干后使用。 琼脂糖凝胶电泳槽、制胶模具用3%的过氧化氢浸泡过夜后，用DEPC水洗净备用。 直量畏申熔患将疡也抱