第一讲基因组测序与序列组装.pptVIP

第二讲 基因组序列诠释 问题 基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？ 基因组作为一个整体如何行使其功能？ 用什么方法寻找基因，研究基因地功能呢？ 1. 寻找基因 1.1 根据开放读码框预测基因 A 起始密码子 ATG 第一个ATG的确定(依据Kozak规则); Kozak规则是基于已知数据的统计结果. 所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律. Kozak规则: 若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1,2，3位，则Kozak规则可描述如下： (1)第4位的偏好碱基为G； (2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T； (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； (4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。 B 信号肽分析 信号肽分析软件(SignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP ) 把预测过程中证实含完整mRNA 5’端的序列翻译为蛋白序列; 然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从第一个ATG对应的甲硫氨酸Met开始)进行评估，如果SignalP分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽; C 终止密码子 终止密码子: TAA, TAG,TGA GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一次； GC% 50% 终止密码子每100－200 bp 出现一次； 由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因此最可能的选择应该是 ORF 不少于100 个密码子。 D 3’端的确认 3’端的确认主要根据Poly(A)尾序列,若测试DNA片段不含Poly(A)序列，则根据加尾信号序列“AATAAA”和BLAST同源性比较结果共同判断。 E 非编码序列、内含子 高等真核生物多数外显子长度少于100 个密码子，有的不到50个密码子甚至更少； F 密码子偏爱性 编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。 不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多为GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。 G 外显子－内含子边界 外显子和内含子的边界有一些明显的特征， 如:内含子的5‘端或称供体位（donor site）常见的顺序为 5’－AG↓GTTAAGT-3’； 3’端又称受体位（acceptor site), 多为5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)； H 上游控制顺序 几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表达。 通过同源性比较来预测mRNA的5’端，最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http://www.epd.unil.ch/ )。 另外个别生物基因组的特有组成也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛。 I 软件预测 采用NCBI的ORF预测软件 ( ORF finder: /gorf/orfig.cgi )判断ORF的可能范围。 1.2 同源查询途径 通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。 同源有如下几种情况： A DNA序列某些片段完全相同； B 开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子； C 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性； D 模拟多肽高级结构相似 1.3 试验分析 Northern 杂交确定DNA片段是表达序列. 注意事项： a 当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带; 如果该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息； b 考虑组织专一性和发育阶段的问题； C 基因表达产物丰度的问题 如果风度较低，用拟Northern 杂交和动物杂交（Zoo-blotting）分析。 拟Northern 杂交—— 根据已知的DNA顺序设计引物，从mRNA群体中扩增基因产物，再以DNA为探针与之杂