绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达.pptVIP

300uL分成3份，2份分别加入重组质粒2uL，轻匀，冰上30min；1份平行操作（对照） 42度水浴热击90S，迅速冰上冷却5min 两管中分别加入LB液体培养基100uL，匀，37度振荡培养30~60min 涂平板： a）分别取50、100、150uL加入重组质粒的感受态细胞悬液涂布于含抗生素的平板 b）抗生素板+IPTG+100uL重组质粒的感受态细胞悬液 c）对照组感受态细胞100uL+抗生素平板 d）正面向上放置片刻，后37度倒置培养20h 重组阳性克隆菌接至3mL LB（Kan）液体培养基中，37度培养16h 过夜菌1:50比例接种至4支试管中（每支试管含3mL LB(Kan)），扩大培养2h，测量A600值为0.5，停止 分别使用IPTG（最后总浓度为1mmol/L）诱导0,2,4h 离心并照相 /view/992207.htm /view/2261117.htm 郝福英 周先碗 朱玉贤 主编《基础分子生物学实验》 北京大学出版社 2010年11月第一版 GFP pEGFP-N3和pET-28a 实验内容 实验目的 实验原理 实验过程 绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP) 基因来源于Jellyfish Aequorea Victoria， 是Shimomura等于1962年发现的蛋白质，由238个氨基酸组成，分子量约为27Kd。GFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定 在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测； 无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率； 蛋白本身性质稳定； 可在多种异源生物中表达且无细胞毒性； 其基因片段长度较小(约717 bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性 EGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子。 丝氨酸－酪氨酸－甘氨酸 生色基团 蛋白质折叠，生色基团得以“亲密接触”, 经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。 蓝光、绿光与黄光 基因克隆 变体 分子标记 药物筛选 融合抗体 生物传感器 信号传导 标记！ 真核细胞表达载体，pEGFP-N3载体上携带有EGFP蛋白表达基因 很强的复制能力 高效的功能强大的启动子SV40和PCMV 多克隆位点 具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞 原核蛋白表达引用最多的系统 在任何E.coli表达系统中，基础表达水平最低 真正的调节表达水平的“变阻器”控制 提供各种不同融合标签和表达系统配置 具有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 许多载体以LIC载体试剂盒方式提供，用于迅速定向克隆PCR产物 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 表达载体和宿主菌的选择 E.Coli BL21（DE3）是表达宿主菌 得到重组质粒pET-28a-GFP 转入表达菌株E.Coli BL21（DE3） 经培养后用IPTG进行三个时间梯度的诱导 表达GFP，紫外线下观察 掌握重组蛋白的基因表达和蛋白检测设计思想 学习分子生物学实验主要操作技术 实验仪器 实验材料 实验试剂 将pET-28a-GFP重组质粒转化入表达菌株 · 制备BL21（DE3）菌株的感受态细胞 10uL BL21（DE3）菌液接入3mL LB液体培养基，摇床培养过夜 二次活化：1:50比例接入新的试管摇床培养2h 1.5mL冰上10min 4 度，4000r/min离心2min收集细胞 弃培养液，加入预冷的Cacl2液600uL，轻悬，冰上20min，4度，4000r/min离心2min 弃上清液，加入预冷的Cacl2液500uL，轻悬，冰上5min， 4度，4000r/min离心2min 弃上清液，加入预冷的Cacl2液300uL，轻悬，即可