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实验1 大肠杆菌的培养和分离 一、大肠杆菌 细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。（由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。） 大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。 二、培养基配置 微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤： 1．称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3．调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 5．倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。 倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。 三、灭菌和消毒 1．无菌技术：①对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；②将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；③为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行；④避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 2．消毒方法：①日常生活经常用到的是煮沸消毒法；②对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法（貌似光明牛奶用的就是巴氏消毒法）；③对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；④实验操作者的双手使用酒精进行消毒。 3．灭菌方法：①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；②培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；③表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。 4.消毒与灭菌的区别： 消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。 灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 注意事项：①实验中用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。灭菌后，通常在60～80℃烘箱中除去灭菌时的水分；②物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是有利于锅内温度升高，随后关闭排气阀继续加热，加热结束切断热源后，要使温度自然降低，气压务必降至零时打开锅盖，其目的是防止容器中的液体暴沸；③在用任何器皿转接时，瓶塞和封口膜只能夹在手上，不许放在台面上，接种时要在酒精灯火焰旁操作（这次的1B貌似也涉及了，很重要哦）；④培养基一定不能沾在三角瓶口、试管管口和培养皿壁上，否则容易污染；⑤接种时要胆大心细，动作快捷，这是减少污染的关键；⑥接种后，培养皿必须倒放（盖在下方）在恒温培养箱中，如正放则水蒸气在盖上凝成水滴，滴到接种后的培养基表面，水流扩散会使菌落扩散，就很难形成单菌落了。 四、细菌的分离 1．划线分离法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养10～20h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。（有些类似于用毛笔写字