详谈人脐血间充质干细胞培养方法的比较.docVIP

详谈人脐血间充质干细胞培养方法的比较 　　0 引言 Introduction 　　关节软骨是一层低摩擦、高弹性、高渗透性的软骨组织，能够承受巨大的力学负荷，在关节活动中起重要作用，主要由透明软骨组成。关节软骨极其脆弱且自身修复能力低下，若未及时治疗，75%可进行性地发展成为骨性关节炎，严重影响生活质量。软骨缺损是骨科临床工作中面临的难题，如创伤、肿瘤等原因会造成软骨缺损，应用组织工程技术进行软骨缺损修复是近些年来的研究热点。脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞，可用于细胞移植，治疗多种疾病。脐血间充质干细胞来源充足，作为骨髓间充质干细胞的替代来源，具有采集方便，免疫原性低，发育阶段更原始、分化潜力更大等优点。本研究利用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离脐血单核细胞，并应用MesenGro人间充质干细胞培养基和DMEM培养基贴壁培养进行分离纯化脐血间充质干细胞，比较其生物学特性的差异。 　　1 材料和方法 Materials and methods 　　设计： 　　细胞学对比观察实验。时间及地点：实验于2014年2至5月在深圳市第二人民医院中心实验室完成。 　　材料： 　　脐血标本：采集自深圳市第二人民医院产科，征得家属和孕妇的同意，签署捐献脐血的同意书。产妇无急、慢性感染及血液系统疾患，新生儿为足月顺产，出生后无感染征象，采血量平均为50 mL。 　　实验方法： 　　脐血的采集：新生儿娩出后，立即剪断脐带，按顺序用生理盐水、碘伏、乙醇消毒脐静脉，注射器抽取5 mL肝素湿润管壁，针头刺入脐静脉并采集脐血50 mL，注入采血瓶，肝素抗凝，浓度20 U/mL，保存在4 ℃环境下，6 h内对脐血进行处理。Ficoll密度梯度离心法分离脐血单核细胞：在50 mL离心管中加入13 mL Ficoll-Paque单核细胞分离液，将肝素抗凝的脐血按3∶1的比例沿管壁缓慢滴入单核细胞分离液面之上，注意保持清楚的界面;将离心管置入离心机中，2 000 r/min，4 ℃，离心20 min。离心完成后，取出离心管，吸管插入界面层，吸取单核细胞，置入另一离心管中，生理盐水洗涤2次备用。 　　贴壁培养法分离纯化脐血间充质干细胞： 　　为了探讨、比较不同培养基对脐血间充质干细胞培养、扩增、纯化的效果，作者将Ficoll密度梯度离心法分离得到的脐血单核细胞随机分为两组，20份用MesenGro人间充质干细胞培养基进行培养，20份用DMEM培养基进行培养。具体步骤如下：将准备好的细胞以1.0times;106/cm2(T25培养瓶)的密度接种于MesenGro人间充质干细胞培养基/DMEM培养基中，MesenGro组按1∶24的比例加入MSCprime原代间充质干细胞添加液，加入体积分数为10%的胎牛血清，按1∶100的比例加入青、链霉素，加入10 mu;g/L碱性成纤维细胞生长因子，置入37 ℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度的培养箱内培养，24 h后全量换液，弃掉未贴壁细胞，观察细胞生长情况，每3 d换液1次，待细胞长到90%融合时，用0.25%胰酶-EDTA进行消化，显微镜下控制消化时间，按1∶2的比例接种于培养瓶中进行传代培养。 　　脐血间充质干细胞的形态学观察： 　　通过倒置生物显微镜每日观察细胞的生长情况和形态特征，并进行记录和拍照，并用细胞计数板进行细胞计数。 　　脐血间充质干细胞的表面标志检测： 　　取生长良好的原代脐血间充质干细胞，去掉培养液，PBS洗涤2遍，加入0.25%胰酶-EDTA进行消化，置入离心管中，将离心管置入离心机中，1 000 r/min，4 ℃，离心5 min，弃上清，PBS洗涤培养瓶，加入离心管中，再次将离心管置入离心机中，1 000 r/min，4 ℃，离心5 min，重复前两步操作直至培养瓶内无间充质干细胞，将得到的细胞制成细胞悬液，加入Anti-CD73/FITC 、Anti-CD105/FITC 、Anti-CD45/FITC、Anti-CD34/FITC，室温孵育30 min，Navios流式细胞仪检测。 　　主要观察指标： 　　梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、原代细胞培养时间和数量。 　　统计学分析： 　　计量数据用x_plusmn;s表示，利用SPSS 21.0软件进行分析。对两组梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、培养时间、原代细胞数量进行t 检验，以P lt; 0.05为差异有显著性意义。 　　2 结果 Results 　　2.1 不同培养方法对脐血间充质干细胞的影响 　　MesenGro组细