谈动脉粥样硬化大鼠颈总动脉糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体的表达及意义.docVIP

谈动脉粥样硬化大鼠颈总动脉糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体的表达及意义 　　当前，冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)已成为威胁人类健康的主要“杀手”。冠心病患者如果动脉壁上的斑块形成溃疡或破裂，则会形成血栓，重者使整个血管血流完全中断，而发生急性心肌梗死，甚至猝死。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(glucocorticoid-induced　tumor　necrosis　factor　receptorligand，GITRL)是属于肿瘤坏死因子(tumornecrosis　factor，TNF)家族的Ⅱ型跨膜蛋白，其胞外区与其他TNF家族成员有20%的同源性。GITRL主要是组成性地高表达于血管内皮细胞或一过性在抗原提呈细胞(如树突状细胞、B细胞、巨噬细胞)和一些肿瘤细胞表面表达[2]。GITRL是糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-inducedtumor　necrosis　factor　receptor，GITR)的天然配体，能够跨膜将膜外的信号转导到膜内。直接刺激GITRL可以像刺激GITR一样增强单核巨噬细胞的功能，诱导巨噬细胞聚集，以剂量依赖的方式上调细胞因子白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)、单核细胞趋化蛋白1 (monocyte　chemoattractantprotein，MCP-1)、IL-1和TNF-alpha;的表达。GITRL在细胞的免疫反应、炎性反应等一系列生理病理过程中发挥着重要的作用。当内皮细胞受到损伤后，GITRL/GITR作为T 细胞活化的共刺激分子，通过激发胞内信号来调控T细胞，进而诱发一系列的炎性因子、趋化因子的产生。本研究通过高脂饮食建立大鼠动脉粥样硬化模型，观察颈总动脉的血管病变及管腔的炎性反应程度，检测颈总动脉中GITRL的表达，探索GITRL可能的炎性反应机制。 　　1　资料与方法 　　1.1　实验动物及分组 　　雄性SD大鼠60只，体质量150～250　g，购自上海斯莱克实验动物中心。将60只大鼠随机分为正常饮食组和高脂饮食组，每组30只。 　　1.2　动脉粥样硬化模型建立 　　正常饮食组以基础饲料喂养，高脂饮食组以高脂饲料喂养。高脂饲料配方：4%胆固醇，10%猪油，0.2%甲基硫氧嘧啶，86%基础饲料(购自上海斯莱克实验动物中心)。喂养时间为6个月。 　　1.3　标本采集 　　用10%水合氯醛溶液麻醉(0.1g/100　g)大鼠，取颈部正中切口，暴露气管，用血管钳钝性分离颈总动脉、颈静脉及迷走神经，游离出一段长约2　cm的颈总动脉，在近心端和远心端分别结扎，剪断血管。将部分标本浸泡于10%甲醛溶液，用于病理分析，其余新鲜标本于液氮冰冻后用于分子生物学检测。 　　1.4　病理组织学染色 　　将标本用石蜡包埋后切片，片厚2mu;m。漂片水温50℃，烘片温度90℃。将石蜡切片装上片架，置于60℃烘箱干烤1　h至石蜡融化，趁热依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95% 乙醇、90% 乙醇、85%乙醇、80%乙醇、75%乙醇、70%乙醇、双蒸水中，各5　min。将脱水后的石蜡切片置于pH6.0的0.01　mol/L枸橼酸盐缓冲液槽中，水浴加热至100℃，维持30　min。随后进行HE、油红“O”及弹力纤维(EVG)染色。 　　1.5　病理诊断动脉粥样硬化的标准 　　动脉粥样硬化大鼠动脉管壁增厚，平滑肌细胞增生，细胞排列紊乱，弹性纤维层结构不清，局部管壁向管腔突出，形成纤维增生性斑块(由平滑肌细胞及脂类堆积形成)。部分斑块表面出现纤维帽，纤维帽下由增生的平滑肌细胞、巨噬细胞及泡沫细胞组成。 　　1.6　GITRL表达的检测 　　1.6.1　蛋白质印迹(Western　blotting)法 　　取冰冻的颈总动脉组织，加入预冷并预混有蛋白酶抑制剂cocktail的放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液100mu;L，匀浆震荡混匀，置冰浴裂解20　min，12　000r/min离心10　min后收集上清液，用BCA法测定蛋白样品浓度。将蛋白样品与等体积2times;上样缓冲液混匀，置于100℃水浴，煮沸5　min。配制120　g/L聚丙烯酰胺凝胶，按照每泳道蛋白总量相等的原则计算上样量并上样，80　V 电压下电泳20　min，待蛋白样品条带压缩后以100　V 电压电泳90min。300　mA 恒流转膜3　h。取出PVDF膜，用30　g/L 牛血清白蛋白(bovine　serum　albumin，BSA)封闭1　h;以1∶200稀释的鼠抗GITRL抗体(美国Biolegend公司)在室温孵育3　h，TBST洗涤5　min，洗3次;以1∶10　000稀释的辣根过氧化物酶