实验二微量凯氏定氮法测定总氮量.pptVIP

实验二 总氮量的测定―凯氏定氮法 一 目的：学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和操作技术 二 原理：通过含氮有机物与浓硫酸共热生成硫酸铵，后与浓碱反应产生氨经硼酸吸收后用标准无机 酸滴定即可测出待测物中的总氮量 三 试剂：浓硫酸（化学纯）、粉末硫酸钾—硫酸铜混合物、NaOH、硼酸、盐酸、田氏指示剂（甲烯蓝乙醇与甲基红乙醇混合）、面粉 四 器材：凯氏定氮烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、50ml容量瓶、3ml微量滴定管、分析天平、烘箱、电炉、100ml蒸馏烧瓶、小玻璃珠 五 操作步骤 六 实验报告 二、原理 生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。 甘氨酸的消化过程可表示如下： CH2NH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2十4H2O十NH3 2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。 本法适用于0.2 ~ 2.0 mg的氮量测定。 三、试剂 1、浓硫酸 200mL 2、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物 16g  K2S04与CuS04.5H20以 3：1配比研磨混合 3、30％氢氧化钠溶液 1 000 mL 4、2％硼酸溶液 5 000 mL 5、标准盐酸溶液(约0．01 mol／L) 6、混合指示剂(田氏指示剂)  由50mL0．1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0．1％甲基红乙l醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。 7、市售标准面粉和富强粉各2g 五、操作方法 1.样品处理 原因: 某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(％)。 方法:一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。 在称量瓶中称一定量磨细的样品(如0.1 g左右的干燥面粉)，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。 若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。 2消化 取4个100mL凯氏烧瓶 标号。各加l颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂(K2S04―CuS04?5H2O)200 mg，消化液5 mL。在3及4号瓶中各加0，1 mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放―漏斗，在通风橱内的电炉上消化。注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。 当消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。 定容：冷却后，加蒸馏水约10 mL。(注意慢加，随加随摇)。然后将瓶中溶物倾人50 mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并容量瓶，用水稀释到刻度，混匀备用。 改进型凯氏定氮仪结构 特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。 (1)水蒸汽发生器和反应室 (2)冷凝器和通气室 (3)排水柱 关键:搞清水管系统 　蒸馏器的洗涤 １． 接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水(先关闭进水口,再关闭出水口,以排水口高度为宜),用酒精灯将其加热烧开。 ２．水的自动喷出： 将蒸馏水由加样室加入反应室， 将酒精灯移开片刻， 打开自由夹，使冷水进入蒸汽发生器， 如此反复清洗3-5次。 ３．清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，2％硼酸溶液和1～2滴指示剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。 3蒸馏过程： 准备: 取50 mL锥形瓶数个，各加入5 mL 2％硼 酸溶液和1―2滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。 关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将一