辽宁省地方标准鱼类物种鉴定PCR-RFLP结合基因芯片分析.docVIP

ICS?01.040.67 B50/59 ????? DB21 辽宁省地方标准 DB 21/ T XXXX —XXXX ????? 鱼类物种鉴定 PCR-RFLP结合基因芯片 分析法 the identification of fish species— the method of PCR - RFLP combined with gene chip 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 ????? XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 辽宁省质量技术监督局???发布 前??言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第一部分标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：大连出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：闫平平、齐欣、田卓、崔妍、徐文英、刘莹、曲世超、尚宝玉、陈溪、黄大亮。 本标准系首次发布的地方标准。 鱼类物种鉴定 PCR-RFLP结合基因芯片分析法 范围 本标准规定了远洋捕捞鱼类和沿海地区经济鱼类物种鉴定方法 PCR-RFLP结合基因芯片分析法的技术规范要求。 本标准适用于鱼体肌肉组织，鱼糜及其鱼制品中鱼基因组的检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 27025 检测和校准实验室能力的通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 物种 物种是生物分类学的基本单位，也是生物繁殖的基本单元。物种是互交繁殖的相同生物形成的自然群体，与其他相似群体在生殖上相互隔离，并在自然界占据一定的生态位。 PCR-RFLP polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性聚合酶链式反应 基因芯片 基因芯片也叫DNA芯片、DNA微振列、寡核苷酸阵列。基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。 抽样与制样 将实验室样品粉碎，充分混匀后待用。 防污染措施 PCR检验过程的防污染措施应符合GB/T 27403的规定 原理 RFLP是根据不同品种基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点直接发生了碱基的直接插入、缺失，导致酶切片段大小发生变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种的DNA水平的差异，多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。PCR-RFLP的基本原理是PCR扩增目的DNA扩增产物在有特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在基因芯片分析仪上分辨，不同等位基因的限制性酶切位点分布不同， 产生不同程度的DNA片段条带。 仪器设备 电子天平：感量0.001g 台式离心机（最高转速15000g），台式小型离心机 双温水浴锅（37℃±1、65℃±1） 漩涡振荡器 低温冰箱（2℃-8℃）、冷藏冷冻冰箱（-20℃） 荧光PCR仪; 高压灭菌锅 实时荧光PCR仪 芯片电泳仪(2100生物分析仪)。 微量可调移液器及配套吸头 主要试剂 除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和Dnase的分析纯或生化试剂。条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T 27025 的规定。 DNA提取试剂盒 PCR-RFLP鱼种鉴定试剂盒(包括 PCR扩增试剂盒和限制性内切酶酶切试剂盒)，试剂盒内包括细胞色素b基因特异性片段扩增用2×PCR Master Mix、PrimerMix、dH2ODde I、HaeIIINlaIII及Buffer等。 DNA 1000芯片试剂盒； 其他PCR相关制品均购自生物公司。 检测步骤 样品预处理 剪取样品50~ 100 mg大小的组织，混合均匀后捣碎后放入 1.5 mL微量离心管 (Eppendorf)中待用。 基因组DNA提取 待用样品加入 20μL蛋白水解酶 K和200μL蛋白裂解缓冲液,混匀后65℃孵育10 min, 14000 g离心3 min， 取上清液,按照DNA提取试剂盒说明提取鱼基因组。最后将鱼基因组DNA溶于30μL去离子水中(DNA的质量浓度不低于005 mg/L)，于- 20℃保存。 可根据实际情况选择适宜的方法，对于一种动物可以提供几种常用的DNA提取方法，应允许其他提取方法的使用，提取的DNA应满足稳定获得PCR扩增产物要求。 目标 DNA片段的 PCR反应体系 PCR反应体系见表1，每个样品各做二