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第2章离体培养基本技术2
6. 喷雾灭菌(物体表面) 物体表面如超净工作台面、桌面、墙面、双手、植物材料表面等,可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。常用70%的酒精反复涂擦灭菌。 超净工作台 超净工作台置于接种室内,是进行无菌操作的工作区。超净工作台一般由鼓风机、过滤器(多级)、操作台、紫外灯和照明灯等部分组成。在超净台工作面的上方应安装紫外灯,注意勿将紫外灯装入照明灯罩(玻璃板)内,否则不具有杀菌作用。根据风幕形成的方向,可分为垂直式和水平式两类。 工作原理:鼓风机将空气送入由特制的微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超级滤清器”后吹送出来,由于滤清器孔径的限制,直径大于0.3 μm的尘埃、细菌和真菌孢子都不能通过,从而形成连续不断的无菌空气流。 优点:操作方便,预备时间短,工作效率高。超净空气的流速一般为每分钟24-30m,既能防止附近空气的袭扰,又不至于妨碍用酒精灯焰灼烧对器械,有利于保持材料不受污染。 超净工作台(单人) 超净工作台(双人) 三、外植体的灭菌 外植体灭菌的程序:取材→自来水冲洗→70%酒精消毒→无菌水冲洗→消毒剂处理→无菌水冲洗→接种 第一步 预处理 预先灭菌处理,减少初始带菌量 第二步 表面灭菌 在超净台内完成,用70%酒精浸10-30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,加之70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等,以及主要取用内部的材料,则可只用70%酒精处理稍长的时间。 处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。 预处理 表面灭菌 灭菌剂处理 最后一步清洗:清洗要每次3-5 min左右,视采用的消毒液种类,清洗3-10次左右。无菌水清洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 第三步 灭菌剂处理。 备注:升汞又名氯化汞,无色或白色结晶性粉末,质重,无臭。可溶于水、乙醇、乙醚和甘油。升汞是剧毒重金属,毒物危害程度为Ⅰ级(极度危害)。如升汞与皮肤接触,可用大量水冲洗后,湿敷3-5%硫代硫酸钠溶液。升汞液应装在棕色玻璃瓶中贮存。 1995年清华大学才女朱令铊中毒 /s/2007-05-10/154112957398.shtml /s/2007-05-10/154112957398.shtml 附:常用消毒剂的性质 70~75%酒精:具有较强的穿透力和杀菌力,常作为表面灭菌的第一步,它具有浸润和灭菌的双重作用,但不能彻底灭菌,必须结合其他药剂灭菌。一般处理时间为5-30s。 升汞(HgCl2): 剧毒的重金属盐杀菌剂,其杀菌原理是Hg2+与带负电荷的蛋白质结合,使菌体酶蛋白变性失活。使用浓度0.1-0.2%,一般浸泡处理6~12min就可有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌,灭菌效果极好。但用升汞灭菌的外植体材料须用无菌水反复多次冲洗,才能洗去残留的汞,否则会对外植体产生毒害作用。通常用无菌水冲洗不得少于5次。由于升汞的毒性剧烈,使用中务必注意安全。 次氯酸钠(NaClO): 用市售的“安替福民”配制2-10%的NaClO,灭菌时间5-30min,无菌水冲洗4~5次。由于它分解出具杀菌作用的氯气,灭菌处理后易于除去,无残留,既有较强的杀菌力,又对植物无害,是常用的杀菌剂。 漂白粉:低毒有效的消毒剂,一般含10-20%(重量/体积)的Ca(ClO)2,使用浓度一般为5-10%或饱和溶液。因其易吸潮分解而失效,需密封贮藏且不能贮藏太久,应随配随用。 过氧化氢(双氧水):常用6-12%的溶液处理外植体材料,灭菌效果较好,由于该药剂在外植体表面容易除去,又不会损伤外植体,通常用于叶片材料的灭菌。 在用上述药剂进行材料的灭菌处理时,为了使杀菌剂湿润整个组织,有时还需在药液中加入润湿剂。如加入数滴或0.1%的吐温(Tween)80或吐温20,或者用磁力搅拌、超声振动等方法使杀菌剂充分接触外植体,以利于彻底灭菌。 无菌操作的步骤: 在接种前20 min,打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯; 注意:使用操作台之前应开紫外灯15 min以上,以激发空气中的氧分子缔合成臭氧分子 (O3),可以使紫外线没有直接照到的角落产生灭菌效果。由于臭氧有碍健康,在进入操 作之前应关掉紫外灯,10 min后方可入内。 (2) 接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服,并换穿拖鞋等; (3) 上工作台后,用酒精棉球擦拭双手,特别是指甲处,然后擦拭工作台面; (4) 先用酒精棉球擦拭接种工具,再将镊子和剪子从头至尾过火一遍,然后反复过火尖端处,对培养皿要过火烤干; (5) 接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、
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