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第五章 PCR的技术原理教学目的和要求:通过本章的学习，要求学生了解利用 PCR 技术原理所衍生出来的技术方法的种类和工作原理，达到能够自觉合理地利用 PCR 技术为科研服务，PCR 鉴定和诊断；理解PCR介导的克隆和PCR介导的诱变；掌握PCR 技术的基本原理、基本操作程序，引物设计方法。重点、难点： PCR 技术的基本原理；引物设计方法；PCR介导的克隆。教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等 本章思考题：1.简述PCR反应的工作原理。2.循环次数是否越多越好？为何？3. 进行PCR引物设计时应注意哪些原则?4.进行PCR产物克隆的方法主要有哪些？主要参考资料:1.吴乃虎主编. 基因工程原理(第二版) .北京:科学出版社,2002.2. J.萨姆布鲁克等.分子克隆实验指南(第三版).北京:科学出版社, 2002. 3. F. 奥斯伯等著.精编分子生物学实验指南.北京:科学出版社, 2005. 4. [美] 本杰明?卢因编著.基因Ⅷ.北京:科学出版社,2007.5.何光源主编.植物基因工程实验手册.北京:清华大学出版社,2007 第一节 PCR技术原理和工作方式 1983年，由Cetus 公司的Kary Mullis 建立； 1988年耐热的Taq DNA聚合酶被发现和应用，把PCR推向了实用阶段，成为PCR发展史上又一里程碑； 1989年，美国专利局授予PCR技术专利； 1989年，PCR技术被《science》杂志评选为伟大的技术发明； 1989年为DNA聚合酶的分子年； 1993年，Mullis 获得诺贝尔化学奖。 计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了PCR操作程序，使之迅速得到推广。 PCR技术是方法学上的一次革命，生物学及医学领域的一个里程碑，巨大的推动作用。 一、PCR的基本原理 1、 PCR的基本原理 PCR(多聚酶链式反应)是一种体外扩增特异DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板DNA、引物和dNTP的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。由一对引物介导,通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、在dNTP存在下,DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的介于两个引物之间的特异DNA片段。 PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。 一、PCR的基本原理 1、 PCR的基本原理 变性(denaturation)：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链。 变性因素：加热、酸、碱、紫外线等。 一、PCR的基本原理 1、 PCR的基本原理 Tm (melting temperature)：50%DNA分子变性时温度称为熔解温度/解链温度。 一般生理条件下，Tm在85℃ -95℃之间。 影响Tm值的因素： （G+C）含量增加，Tm值增高 溶液的离子强度高，则Tm增加（离子键的形成增多）； 甲酰胺的浓度增加，则Tm下降（使碱基对间的氢键不稳定，可避免G、C含量高的DNA在高温变性时引起断裂而失活）； 若DNA组成比较单一，则变性发生在狭窄的温度范围内. Tm值的计算： Tm = 69.3+0.41(G+C) % Tm = 4(G+C) +2(A+T) （20bp） 一、PCR的基本原理 1、 PCR的基本原理 复性(renaturation)：变性的两条DNA单链在合适的条件下，又可按原来的碱基配对，再结合在一起形成双螺旋构象，又称退火。 复性速度与温度有关，当温度缓慢下降才使其重新配对复性；若将其迅速冷却至4 ℃以下，则几乎不能发生复性（可用来保持DNA 的变性状态）。复性的最佳温度为：Tm-5 ℃。 DNA的序列：简单的—复性快； DNA的浓度：高—复性快（分子多、碰撞机会多）； DNA片段的大小：大—复性慢（分子大、运动慢）； 溶液的离子强度：高—复性快（中和DNA分子上的负电荷，减少两条单