PCR基因扩增课件.pptVIP

PCR基因扩增 一、实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术 二、实验原理 PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法，由美国人B.Mullis于1983年发明 包括三个基本步骤: 变性（Denature）：目的双链DNA片段在94℃下解链 退火（Anneal）：两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃ 左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对 延伸（Extension）：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成 由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106 倍 1、PCR反应中的主要成份 引物 dNTP Mg2+ 模板 Taq DNA聚合酶 反应缓冲液 引物 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定 引物设计和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则： 引物长度约为16～30bp 引物中G+C含量通常为40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度 四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发 引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对 在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构 两引物之间尤其在3’端不能互补，