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PCR引物设计软件primer Premier 5.0 应用简介 温州医学院附属第一医院检验科 陶志华 一. 引物设计的基本原则 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) ΔG值(internal stability) 引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false priming site） 引物及产物GC含量（composition） 1. 引物的长度 一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度 2. 引物3’端的序列 引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高 引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败 3. 引物的GC含量 一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 4. 引物所对应模板序列的Tm值 最好在72℃左右 5. ΔG值(自由能) ， 反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间