RNA病毒的检测课件.pptVIP

第一章 RNA的提取和cDNA的合成 RT-PCR原理 提取总RNA 以其中的mRNA作为模板 反转录 cDNA PCR 作模板 获得目的基因 一、RNA的提取 RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。 RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人的皮肤、手指、试剂、容器等。 采取的措施： 1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。 2、所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中200℃烘烤2h以上。 3、不能用高温烘烤的材料，如塑料容器、试剂等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，然后高压灭菌以消除残存的DEPC。 注意事项： 1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。 2、DEPC能与氨基和巯基反应，因而含Tris和DTT（二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。 总RNA提取方法（试剂盒）： 异硫氰酸胍－苯酚法（Trizol 法） 原理：（1）Trizol的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。酚是有效的蛋白变性剂，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 异