研习与讨论.doc

研習與討論 書面報告 05級 901633 蔡聖輝 前言 我是在分子生物所趙裕展老師的實驗室做暑期生。 趙老師的實驗室主要研究的題材是桿狀病毒(baculovirus) 簡介baculovirus： 在1983年，Smith等人利用遺傳工程技術，成功地利用這苜蓿尺蠖蛾核多角體病毒(AcMNPV)來發展載體系統(baculovirus expression vector system)，並以昆蟲細胞(insect cells)生產出人類?-干擾素(human ?-interferon)之後，此種表現載體系統立即受到重視。經過科學家的努力後，使得此系統的應用技術漸趨成熟。除了以AcMNPV為載體外，1985年Maeda等人也發展出以家蠶核多角體病毒(BmNPV)為載體。而現在，AcMNPV和BmNPV為此系統的主流。 使用此表現系統的優點有：(1)病毒基因體大，可插入大量的外來DNA而不影響正常的DNA複製；(2)病毒的桿狀蛋白鞘可延伸而容納多出來之外來基因；(3)病毒的一些非必要性基因具強勢啟動子，其譯讀區可被多來基因所取代，而不影響病毒的複製與感染力，因此利用這些強勢啟動子，可以製造大量外來基因產物；(4)病毒宿主/昆蟲細胞的轉譯後修飾作用與脊椎動物(例如哺乳動物)類似，使在此系統中表現的脊椎動物的基因產物有必要的醣化等posttranslation的修飾，因此重組蛋白質仍保有蛋白質的生物活性；(5)本系統可用來表現某些對細胞有毒性的蛋白質(cytotoxic protein)，因為其部分特定啟動子(promoter)的基因表現時間較晚，所以可減少此種蛋白質對細胞的作用，並且也不至於影響到病毒的成熟；(6)病毒寄主域窄，僅能感染節肢動物，對使用者(也就是我們)具安全性；(7)昆蟲細胞可用無血清培養基培養，穩定又經濟方便；(8)昆蟲細胞可快速地生長，使外來蛋白可大量製造；(9)昆蟲細胞的蛋白質與人體血清不會產生交叉反應，因此利用昆蟲細胞生產出的外來蛋白質為抗原作診斷時(如作western blotting)，並不需要特別將外來蛋白質純化出來可使用。 趙老師的實驗室簡介： 趙老師在前幾年，便利用此病毒，改良建立有效之非胞裂性之桿狀病毒感染系統。在此系統下病毒不會溶裂細胞，也不會影響細胞生理。經實驗證實以此系統生產之蛋白質相當容易純化，蛋白質產量比傳統胞裂性者高。此系統將對生產分泌性，膜蛋白，醣蛋白等很有助益。分泌性，膜蛋白，醣蛋白最近，本實驗室也以 DNA 組合的方式，合成一個強早期起動子。此和目前廣為使用之桿狀病毒之極晚期起動子的強度類似，但製作之蛋白的品質更好，活性更高。此些原創性的發明，將會大幅改革桿狀病毒載體系統之應用。也會對生物科技注入一股重要的新方向。 一、introduction 因為在今年五月左右，台灣有了SARS的疫情，因此目前實驗室致力於製作SARS的疫苗，並提供其SARS部份蛋白質的sample給其它實驗室。 已知SARS virus是冠狀病毒(conoravirus)，而它的膜蛋白 Spike protein會引起人體免疫，所以想利用此特性做出疫苗。又知SARS virus的Envelope protein和Membrane protein聚在一起，會自行形成virus的外膜，如果再加上Spike protein就可以做出一個假的SARS virus，而此假virus就可以引起人體的免疫反應。 S - Spike protein: receptor binding, cell fusion, major antigen E - Envelope protein: small, envelope-associated protein M - Membrane protein: transmembrane - budding envelope formation 而在六~七月時，實驗室已經正在作有關Envelpoe protein和Membrane protein的表現，而一直到七月初，別的實驗室才生產出SARS virus之Spike protein的DNA sequence，所以我就和實驗室的何愈學長一起做這個protein的表現。 利用網路的database，將這段 DNA sequence加以分析，判斷出可能引起免疫反應的片斷有547、763、966三個片斷，所以我們便建構出這三種的載體。 實驗步驟 我主要分為兩個部分： (1) Preparation of vABhRpS547H6； (2) Construction of pABhRpS763rBH6 and pABhRpS966rBH6 (1) Preparation of vABhR