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独一味总黄酮的提取纯化 培训资料 西藏金稞集团有限责任公司 一、独一味的概述 独一味(Lamiophlomis Rotata (Benth.) Kudo) 唇形科独一味属，形态特征 多年生草本。叶呈莲座状，无茎。轮伞花序密集排列成头状或穗状花序；花冠淡紫色、紫红色或粉红褐色。花期 7-8 月。 耐寒、耐干旱、瘠薄。产西藏大部，常生于海拔 3900-5100m 的高山碎石滩、河滩地或石质草甸。分布于青海、甘肃、四川西部及云南西北部，尼泊尔、锡金、不丹也有。是藏、蒙、纳西等民族民间草药,具有止血、镇痛、活血化瘀、抗菌消炎、增强免疫力等作用。 在我国一千多年前的藏医学名著《四部医典》和《晶珠本草》中就已有记载。藏医将其用于骨髓炎、关节黄水病、骨折、跌伤、枪伤等。 独一味主要化学成分为黄酮类、苷类、挥发油类和其他类成分，其中黄酮为其主要成分，化学研究表明独一味中黄酮类成分主要是芹菜素、木犀草素、槲皮素及其苷类。近年来，随着对民族药开发的不断深入，研制了独一味的胶囊、片剂等剂型，临床使用越来越广泛。该药在止血镇痛消炎等方面的独到疗效，受到了广大患者和医务人员的欢迎。 二、独一味总黄酮的提取纯化 1．乙醇回流提取 以不同的乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度进行提取，确定每个单个因素对独一味总黄酮类成分提取的影响。 1.1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响 取独一味药材粉碎的粉末10 g于250mL圆底烧瓶中，分别加入质量分数为40％ 、50％ 、60％ 、70％ 、80％ 、90％的乙醇100 mL，在80℃ 的恒温水浴锅上加热回流提取1次， 2 h，滤过除药渣，合并滤液，减压浓缩至干燥浸膏。 1.2 料液比对总黄酮提取率的影响 取独一味药材粉碎的粉末10 g于250mL圆底烧瓶中，分别加入60、80、100、120、140、160 mL质量分数为80.0％ 的乙醇，在80℃ 的恒温水浴锅上加热回流提取1次， 2 h，滤过除药渣，合并滤液，减压浓缩至干燥浸膏。 1.3 提取时间对总黄酮提取率的影响 取独一味药材粉碎的粉末10 g于250mL圆底烧瓶中，加入100 mL质量分数为80％的乙醇，在80℃ 的恒温水浴锅上加热回流提取1次，提取时间分别为1、2、3、4、5、6 h，滤过除药渣，合并滤液，减压浓缩至干燥浸膏。 1.4 提取温度对总黄酮提取率的影响 取独一味药材粉碎的粉末10 g于250mL圆底烧瓶中。加入100 mL质量分数为80％ 的乙醇。分别在40、50、60、70、80、90 ℃ 下在80℃ 的恒温锅水浴上加热回流提取1次， 2 h，滤过除药渣，合并滤液，减压浓缩至干燥浸膏。 经以上分析各单因素对独一味总黄酮提取的影响，确定最佳提取工艺为：取一定量的独一味药材粉碎、过20目筛，投入提取罐内，加80％乙醇浸泡过液，料液比1：10，80℃下热回流提取3次，每次3h，滤过除药渣，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩至干燥浸膏。 总黄酮收率=黄酮量(mg)/药材量(g) 2．总黄酮的纯化工艺 独一味总黄酮浸膏加10 倍量的蒸馏水充分搅拌，静止过夜后，底层析出油状沉淀，滤过除沉淀，得上清夜，取上清液经适当处理后作为母液，待上柱。 2.1 树脂的预处理 HPD100大孔树脂使用前需除去其中可能有毒性的有机残留物，必须经过预处理。取适量树脂，用 95％的乙醇反复浸泡，使其充分溶胀和初步除杂。用乙醇洗涤至流出液加适量水无白色浑浊现象后，再用蒸馏水洗至流出液无醇味，备用。 2.2 大孔树脂对总黄酮的纯化 总黄酮母液制备成浓度为8.8 mg/ml的药液，取80ml该药液上样已处理好的HPD-100型树脂（干树脂8g）上，过柱液重吸附一次，上样速度为1BV/h，吸附完全后，用蒸馏水洗至无色，再用50％乙醇洗脱，流速为1BV/h，洗脱溶剂洗脱体积为 4BV，收集各部分洗脱液，减压浓缩干燥，即得独一味总黄酮粉末。 图1.独一味总黄酮提取纯化工艺流程图 三、独一味总黄酮含量的测定 1．对照品溶液的制备 精密称取在120 ℃减压干操至恒重的芦丁对照品20 mg，置100 ml 量瓶中，加70 %乙醇70 ml,置水浴上微热使溶解，放冷，加70 %乙醇至刻度，摇匀，即得(每1 ml 中含无水芦丁0.2 mg) 。 2．标准曲线的制备 精密量取对照品溶液1.0 ml，2.0 ml，3.0 ml，4.0 ml，5.0 ml，6.0 ml，分别置25 ml量瓶中,加水至6 ml，加5 %亚硝酸钠溶液1 ml，混匀，放置6 min，加10 %硝酸铝溶液1 ml，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min；以相应的溶液为空白。按分光光度法，在500 nm 波长处测定吸收度，以吸收度（A）为