具有催化能力的RNA-大连大学生命科学与技术学院.pptVIP

具有催化能力的RNA 1989 切赫（T.R.Cech 美国）奥尔特曼（S.Altman 加拿大） 切赫(Thomas Robert Cech)，美国生物化学家，1947年12月8日生于美国芝加哥。在柏克莱加大学获得博士学位，并在麻省理工学院从事博士后研究。1978年后在科罗拉多大学任教。切赫于1981年后全力投入到RNA(核糖核酸)分子催化功能的研究，并取得了非凡的成就。他发展了奥尔德曼的研究成果和学说。提出用分子层次上的化学理论来解释RNA分子的自我催化机理。因此，他为建立生命科学在分子层次上的理论基础作出了贡献。为此，他和奥尔特曼共同获得了1989年的诺贝尔化学奖，时年42岁。在此之前，切赫因核酸性酶的发现而获得了声望很高的1988Lasker奖。 切赫还热忠于历史学与考古学，研究过中国历史，并发表过《论中国古代酷刑制度》和《19世纪末至20世纪初的清国外交策略》等文章。于2003年参与了对埃及的考古工作。 奥尔特曼(S.Altman) 加拿大人,因发现RNA的生物催化作用而获奖. 1978年和1981年奥尔特曼与切赫分别发现了核糖核酸(RNA)自身具有的生物催化作用,这项研究 不仅为探索RNA的复制能力提供了线索，而且说明了最早的生命物质是同时具有生物催化功能和遗传功能的RNA，打破了蛋白质是生物起源的定论。 20世纪80年代中期，切赫与奥尔特曼用各自独立的实验方法，证实了某些前体RNA具有催化功能。 切赫：四膜虫rRNA前体的自我剪接实验 1. 实验梗概： 1981年切赫发现原生动物嗜热四膜虫的大核26srRNA基因中有一段内含子，该基因转录产物——前体rRNA中相应于这段内含子的核苷酸顺序是一个有413个核苷酸的居间序列(IVS)。在前体rRNA加工过程中，这个IVS可自我催化除,并最后使5’→外显子与3’→外显子连接成成熟的rRNA分子。 切赫研究发现， 在离体条件下，四膜虫大核rRNA前体可在没有蛋白质存在下，由Mg离子和鸟苷或5’鸟苷酸作辅助因子，完全催化剪接过程。 为了证明剪接过程中，确实没有蛋白质参与，切赫用重组DNA技术得到四膜虫rRNA基因中的413bP连同两侧的DNA克隆片段，将其离体转录出相应的RNA，再进行SDS-酚抽提，以保证转录产物前体rRNA不与酶蛋白结合，在电泳图谱上可看到环状IVS，线状IVS和缺失15个核苷酸的线状物3条谱带，结合其他一些实验结果，可以充分肯定前体rRNA可在非酶蛋白质存在条件下进行自我剪接。 2. 四膜虫rRNA前体的自我催化反应机制 四膜虫rRNA前体的自我催化剪接过程是由两步转磷酸酯反应完成的，反应中，不需要外源ATP或GTP提供能量。首先，在Mg2+存在下，鸟苷或5’鸟苷酸的3’—OH作亲核试剂攻击IVS的5’—剪接位点，使鸟苷或鸟苷酸的3’—OH与IVS的5’—磷酸共价连接，之后，5’—外显子中3’端的羟基作亲核试剂攻击IVS的3’—剪接位点，经转磷酸酯反应使5’—外显子通过UpU共价相连，得到成熟的rRNA，切除的IVS3’端鸟苷的3’—OH攻击IVS5’端邻近的磷酸二酯键，使IVS5’端的15个核苷酸片段缺失，而形成一个由3’—5’磷酸二酯键相连的环状分子。 通过核苷酸顺序分析，发现四膜虫大核rRNA前体的IVS有6段保守顺序为：(5’)qR′—A—B—qL—qR—2(3’)，而且，A与B，qL与2，qR与qR’相互配对，使IVS折叠成一定的二级和三级结构，结合IVS内的位点专一突变或小段缺失和与IVS互补的寡聚脱氧核苷酸以及高温、高浓度变性剂都将导致IVS催化活性的丧失等事实，说明IVS的催化活性可能由其自身的某种特定的精确三维空间结构所确定。 Cech等(1986年)进一步研究证明四膜虫大核rRNA前体自我剪接后所形成的环状IVS可水解成一个比完整IVS少了5’端19个核苷酸的线状IVS称为L-19IVS，在离体条件下，L-19IVS可催化五聚胞苷酸形成多聚胞苷酸，说明L-19IVS具有核苷酸转移酶、磷酸二酯酶、磷酸转移酶、酸性磷酸酯酶和RNA限制性内切酶等5种酶活性。 对大量真核生物RNA前体的剪接方式进行研究的结果表明，有许多RNA前体的剪接并不需要酶蛋白质参与，而由IVS自我催化完成，根据这些IVS的结构及剪接方式，可将这些RNA分为两类。第一类，IVS结构与四膜虫大核rRNA前体的IVS相似，剪接方式也一样，反应需要鸟苷或5’鸟苷酸和Mg2+作辅助因子。第二类，IVS的结构不同于第一类，剪接时不需要鸟苷或5’鸟苷酸，但需要Mg2+参与反应，最后使IVS形成套索结构而被除去。 奥尔特曼：RNaseP