(二) 蛇伤免疫学诊断.docVIP

（二） 蛇伤的免疫学诊断 蛇伤的诊断，目前国内外普遍是根据咬伤时临床症状或捕获的蛇来确诊，但由于大多数的蛇伤是在晚间或山林草地中发生的，有时看不到蛇或看不清蛇种。据国内外统计，只有20%左右的蛇伤病人能确定蛇种[1]。这样只能根据被咬的牙痕、局部体征以及常规化验等进行诊断。但在蛇伤早期，临床症状往往不明显、不典型，所以很难确诊，以至延误病人的治疗，失去及时抢救的良机。因此，必须寻求一种快速、准确、敏感、简便的蛇伤化验诊断方法。 1．蛇伤的免疫学诊断研究进展 多年来，免疫学家们根据抗原抗体反应的原理，应用免疫学技术．检测病人标本中各种毒蛇的种特异性蛇毒成分，进行致伤蛇种的各种免疫学诊断方法的研究．随着现代免疫学技术的不断发展，蛇伤免疫诊断的迫切性，今天已成为可能性。并在技术上逐渐取得了重大的进展和突破，早在五十年代末就有人提出这个问题。但是它的主要研究进展还是在上世纪和八十年代后。蛇伤的免疫诊断发展大致可分成3个阶段。 （1）免疫学诊断的出现期 1957年Muelling等[2]应用环状沉淀反应及双向琼脂扩散法论证了一个被眼镜蛇咬伤8h的17岁女孩组织中的眼镜蛇毒，首先提出了蛇伤的免疫诊断问题．Trethewie等[3]于1969年报告了他们成功地用凝胶免疫扩散法从豚鼠咬伤部位的盐水浸出液中检出了虎蛇毒和蝮蛇（Adder）毒。1974年Greenwood等[4]应用免疫扩散和对流免疫电泳等法检测蛇伤中毒病人伤口吸出液、水泡液、血清和尿液中蛇毒的种特异性成分，进行蛇伤的致伤蛇种免疫诊断的研究。在101例蛇毒中毒的病人(75例已见蛇种，26例蛇伤不明)免疫扩散的检查中，40例被捡出(检出率约40％)。特别是膨身蛇(Puff)。黑颈眼镜蛇(Naja Nigricollis)即非洲喷唾沫眼镜蛇(Africum spitting cobra)的咬伤的诊断特别成功(全部检出)。其中伤口吸出液的检出率为27／74，水泡液为9／13，血清为0／84,浓缩尿为19／76。在不明蛇种的26例中也检出11例(其中眼镜蛇伤7例，膨身蛇伤2例，蝰蛇伤2例)并对44例阳性标本用对流免疫电泳法[5]复查，结果40例仍为阳性。并且多数可在30min内得出结果。因此，他们正式提出了蛇伤免疫诊断的可能性。并认为对流免疫电泳法有希望作为蛇伤快速诊断的常规方法。至此，蛇伤的免疫学诊断才真正问世。引起了各国学者们的重视和研究。李云龙等也曾用此法检测过实验性蛇伤动物[6]和79例早期蛇伤病人的咬伤局部吸出液,获得了较为满意的结果[7]。但是，此法的敏感度不够理想，阳性检出率受检材的种类、取材的时间、方法、诊断抗体的质量等因素影响较大，所以要通过更特异的抗体和应用更敏感的免疫检测方法，才能解决蛇伤的免疫诊断问题。 (2)蛇伤免疫诊断敏感度的发展期 七十年代初，由于免疫学技术的水平限制，使免疫诊断在蛇伤中的应用受到了影响。为了提高蛇伤免疫诊断的敏感度，必须采用高敏感的免疫检测方法，才能使蛇伤的免疫诊断得到提高。因此，免疫诊断提出后，当时相继就出现了血凝、放射免疫测定（RIA）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等敏感度较高的方法用于蛇伤的诊断。1968年，Boche和Russell[8]应用a-重氮联苯胺法将响尾蛇（C.Viridis heller）毒致敏绵羊红细胞进行被动血凝试验和血凝抑制试验测定高稀释度的蛇毒抗体和蛇毒抗原，敏感度比对流免疫电泳高的多。但此法结合物不稳定，滴定终点不清楚，试剂必须保存于冷处等缺点。1974年Greenwood等又应用双抗体法放射免疫测定（RIA）进行蛇伤的诊断[9]，测出了毫微克量级(1ng／ml)的毒蛇，大大提高了检测的敏感度，但此法易发生非特异性反应和正常血清的抑制现象。另一个缺点是检出时间太长(24～48小时)。得不到快速诊断的目的。后来Coulter等（1974）[10]Sutherland等（1975）[11]又应用固相夹心法放射免疫测定对蛇伤病的蛇毒人的血清，尿液，组织液中的检测研究。不仅敏感度高，还可作蛇毒的定性定量分析。而且缩短了检测时间(十几小时可得出结果)。随后，Pukrittayakammee等[12]用McAb Mp2作竞争RIA测定蛇伤病人体液中的蝰蛇（Daboia russelli）毒。其敏感度：尿：4ng/ml，血清：5μg/ml。但在不同蛇毒之间有交叉反应。从此使蛇伤的免疫诊断进入了高敏感度水平，大大扩大了该免疫诊断的应用范围。 放射免疫测定的缺点是：设备昂贵，试剂对人体有害，检测时间仍较长，还不能适应快速诊断的要求，也不易普及。也不能在野外现场使用。为了探索另一种高敏感度方法。1977年，Theakston等[13]以双抗体夹心法酶联接免疫吸附测定(ELISA)进行