12.酶法分析.pptVIP

第12章 酶法分析 1.酶法分析的发展 酶在定量分析中的应用可以追溯到19世纪中期。当时，曾采用麦芽提取物作为过氧化物酶源，以愈创木酚作为共底物或指示剂测定过氧化氢。 早在1914年临床上就开始采用脲酶测定尿中的尿素，但是在临床实验室中酶分析的真正突破要推迟到1958年，当时转氨酶分析发展成为诊断肝病和心脏病的一个有效手段。 到了20世纪50年代前已有60种物质能借助于酶法分析。近年来，酶法分析发展迅速，广泛应用于临床检验、食品、环境、生物及其它样品的检测。 2. 酶法分析的特点及应用类型 酶的特性 12.2 酶法分析的方法及应用示例 一.酶活性的测定: 1.初速率法 2.固定时间分析法 3.固定变化分析法 4.偶联法 5.分光光度法及荧光法 6.电化学法 7.其它方法 1.初速率法 2.固定时间分析法 （动力学研究方法）无连续检测设备时，采用间隔一定时间，取出一定体积反应液并终止酶作用进行分析。 要求： 酶活性在催化过程中几乎没变化； 要采用使酶钝化的措施：一般用强酸、强碱、三氯乙酸、过氯酸或SDS使酶失活，也可以用加热的方法终止反应。 4.偶联法测定酶的活性 举例： 葡萄糖+ATP 葡萄糖-6-磷酸+ADP 这个反应中没有明显的光谱性质的变化，无法对于酶活进行测定。但是，葡萄糖-6-磷酸+ADP是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的底物，并在NADP+（辅酶Ⅱ）存在下发生第二个酶反应。 葡萄糖-6-磷酸+ NADP+ 6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+ H+ NADP+的最大紫外吸收在280nm，而NADPH的紫外吸收在340nm，可以测定。 要求： 两个酶催化反映的条件具有相容性； 指示反应在整个反应中是非限速步骤，可以通过加大指示酶的用量来达到。 分光光度法 利用底物与反应产物在紫外和可见光部分光吸收的不同，连续或测定反应一定时间内吸光度的变化。 连续测定法适合于反应速度较快的体系；而固定时间法适用于一些反应速度较慢的体系。 许多氧化还原酶都可以根据反应过程中混合物吸光度的变化测定其活性。 荧光法 酶反应的产物或底物之一有荧光或二者的荧光光谱不发生重叠就可以根据荧光的变化来测定酶的活性。 由于酶分子中常有酪氨酸和色氨酸，它们具有紫外吸收及荧光，在底物的选择时要避开它们的干扰。 电化学法 电位计技术（如pH电极） 对H浓度发生变化的酶促反应，在实际测定时要加入酸或碱以维持溶液的pH不变，这样才能使酶的活力不发生变化。而加入的酸或碱的速度就代表了酶促反应的速度。 极谱法（有氧电极法） 有些酶促反应中，由于氧气的生成或消耗，引起溶液中溶解氧浓度的变化，从而引起电极之间电流大小的变化，由此可以计算出酶的活力，如葡萄糖氧化酶催化的反应。 比气压法灵敏，同时具有抗污染物干扰的特性 其他方法 量气法： 用于反应底物或产物之一是气体的情况 通过测量反应过程中气相的体积或压力的变化便可以计算出气体的释放或吸收的量。再根据气体的变化和时间的关系就可以确定酶的活力。 优点：可以连续取得数据，以便了解整个酶促反应过程。 缺点：灵敏度和准确度都较低 其他方法 量热法： 用非常灵敏的量热计可以测定酶的反应速度。 该法灵敏，无干扰 有些反应的产物还可以与缓冲溶液发生二次反应继续放热，从而增加测定酶活力的灵敏度。 二.酶法分析的应用类型 酶活性的测定 底物及底物类似物的测定 活化剂和抑制剂的分析测定 12.2.1 酶活性的测定 概述 几种酶活力的测定方法 概述 酶的提取纯化 酶活力的表示方法 测定酶活力的四个操作步骤 酶活力的概念 酶活力：就是酶催化反应的能力。用酶促反应初速度(reaction velocity或reaction rate)来表示，即酶催化反应速度愈快，酶的活力就愈高，速度愈慢，酶的活力就愈低。 活力单位(U)与比活力　　其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU，又称U）。 　另外一个国际酶学会议规定的酶活力单位是Kat，规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。 Kat和U的换算关系：1 Kat=6×107U， 1U=16.67n Kat  常规测定酶活力的操作步骤： （1）对样品酶液进行适当稀释 （2）?进行酶促反应 （3）测定反应量：一般是测定反应产物生成量。具体的方法根据被测物质的理化性质而定 （4）计算酶活力（u/ml，u/g） 测定反应量 ①?如果反应物或产物光学性质变化明显，可采用紫外光、可见光、旋光或荧光等光学仪器进行测定 ②如果pH或电化学性质变化大，可采用酸碱滴定或电位滴定等方法测定 ③?如果底物或产物能与