细胞工程5.2单克隆抗体题库.ppt

单克隆抗体 华侨大学生物工程与技术系 杂交瘤技术基本原理 哺乳动物的免疫系统包括体液免疫和细胞免疫，参与这两种免疫反应的细胞有： B淋巴细胞和T淋巴细胞。 B淋巴细胞，进一步发育成浆细胞，浆细胞能产生抗体，抗体参与体液免疫。 T淋巴细胞，进一步发育成吞噬细胞，直接参与细胞免疫。 T细胞不能产生抗体，但可以帮助B细胞产生抗体。 正常的B淋巴细胞不能在体外培养条件下长期生存，因而不能在体外持续产生抗体。而骨髓瘤细胞可以在体外快速生长，但不能分泌抗体。 克隆选择学说 作为抗体生成理论的克隆选择学说是杂交瘤技术产生的理论依据，细胞融合技术和杂交细胞的选择方法是杂交瘤技术产生的技术基础。 克隆选择学说　1957年Burnet提出的克隆选择学说认为：每一个B淋巴细胞有一个独特的受体(现在认为一个B淋巴细胞有结构相同的10万个受体)，抗原进入机体后只刺激具有相应受体的B淋巴细胞，产生与受体特异性相同的抗体分子。一个淋巴细胞只产生一种抗体分子。因此，根据克隆选择学说，一个B淋巴细胞克隆只能产生一种抗体分子。这就是生产单克隆抗体的理论依据。 单克隆抗体与多克隆抗体 单克隆抗体与多克隆抗体的本质区别　 单克隆抗体是源于一个B淋巴细胞的杂交瘤细胞系所分泌的针对抗原的同一表位的抗体； 而多克隆抗体(简称多抗)是由免疫动物的无数不同的B淋巴细胞分泌的针对抗原不同表位的性质各异的混合抗体。 单抗是同质的，多抗是异质的。 杂交瘤细胞的筛选 酶联免疫吸附试验(ELISA)　该法在杂交瘤细胞的筛检和单抗的鉴定中最为常用。 羊抗鼠或兔抗鼠双抗体夹心ELISA　能识别所有鼠源抗体。凡是分泌鼠源抗体的杂交瘤细胞均可被筛选出来，然后再通过间接ELISA或捕获ELISA或其它特异性检测方法确定目的杂交瘤细胞。 间接ELISA和捕获ELISA　能识别与抗原相对应的特异性抗体。一般用于分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的筛选和单抗特异性鉴定。其中捕获ELISA，由于首先用多抗致敏酶标反应板，增强板对抗原的结合能力，因此一般来说它比间接ELISA更稳定和敏感。 液相ELISA　由于抗原和抗体在液相中反应，抗原保持自然构型，所有表位处于完好状态，并可与抗体进行全方位反应，其结果与中和反应较为一致，适于中和单抗的筛选和病毒抗原表位分析。 (2) 免疫酶组化法　主要用于检测针对细胞抗原成分的单抗或细胞上病毒抗原成分的单抗。常用间接免疫过氧化物酶试验(IIP)或碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术(APAAP)，镜检判定结果。 (3) 免疫荧光技术　与免疫组化法相似，主要用于各种细胞抗原成分和感染细胞中病毒抗原成分的检测，具有操作简便、敏感，可对抗原成分直观定位等优点，常用于单抗的筛选和鉴定。凡检测针对细胞内成分的单抗，将细胞片经-20℃冷丙酮固定后作荧光染色；而检测针对细胞内成分的单抗，则用活细胞作膜荧光染色。 (4) 放射免疫测定　在筛选和鉴定单抗时常用固相抗原法，其反应原理与ELISA相似，所不同的是用放射性同位素(如125I)标记的羊或兔抗鼠抗体代替酶标抗体作指示系统。由于同位素半衰期的限制，操作和同位素污染对人的危害以及废物处理的困难，一般实验室很少采用。 (5) 间接血凝试验(PHA)　该法快速、简便、较为敏感、影响因素少，易掌握，也常应用于单抗的筛检。但因敏感性和反应范围的限制，不如ELISA应用广。 杂交瘤细胞的克隆化 融合后必须对阳性孔中杂交瘤细胞进行克隆化，其原因是： ① 融合后阳性孔中的杂交瘤细胞不一定都是目的细胞； ② 一些初生杂交瘤细胞是不稳定的，可能丢失染色体，丧 失产生抗体能力，需不断清除变异细胞； ③ 在液氮中长期保存的杂交瘤细胞也有丧失分泌抗体的可 能。 所有这些情况说明，需对杂交瘤细胞进行连续克隆化，以纯化目的细胞。 杂交瘤技术操作中应注意的主要问题 (1) 对所用的骨髓瘤细胞的使用历史要清楚，即一定是没有污染的曾获得高融合率的可靠细胞。融合时，骨髓瘤细胞要处于最佳生长状态。 (2) 用于融合的主要试剂，如聚乙二醇(PEG)、胸腺密啶核苷(T)、次黄嘌呤和小牛血清的质量要可靠、特别是小牛血清和PEG，就是同一厂家不同批次产品的质量差异也影响融合和培养效果。在实验室中一定要贮备经过融合考验的主要试剂。对每批小牛血清都要作细胞生长试验。  (3) 配液用的水质好坏也是一个重要问题。一般来说，无离子水再经双蒸或三蒸水用于配制各种液体是没有什么问题的。 (4) 在进行杂交瘤试验之前，要调好培养箱温、CO2浓度，使其稳定，并保持饱和湿度。 (5) 严格无菌操作对搞好杂交瘤技术是至关重要的。一切用于培养的液体均需十分可靠。各种培养液的包装尽量要小。同一包装的液