FA-VD-102枸椽酸钾溶液微生物限度检查方法验证方案资料.docxVIP

枸椽酸钾溶液微生物限度检查方法验证方案目的根据《中国药典》2015版草案中的相关规定，建立枸椽酸钾溶液的微生物限度检查方法，并对其进行验证，保证其检验方法的科学性，使检验结果准确可靠。范围本验证方案适用于枸椽酸钾溶液的微生物限度检查方法的验证。人员与职责质量控制人员负责验证方案与报告的起草，并按照批准的方案实施，完成检验相关数据的采集；质量保证人员负责验证方案和报告的审核；质量管理负责人负责验证方案和报告的批准。培训本方案实施前应对参加验证人员进行培训，并做好培训记录确保进行验证的人员均能熟悉、掌握验证过程。验证方案制剂信息枸椽酸钾溶液为枸橼酸钾溶于水后加入羟苯乙酯醇溶液配制而成，其配制处方中加入的羟苯乙酯作防腐剂使用，有较强的抑菌作用。其质量标准中规定应进行微生物限度检查，每1ml样品中细菌数不得超过100cfu，霉菌和酵母菌数不得超过100cfu，并不得检出大肠埃希菌。根据以上特点，本方案中按《中国药典》2015版草案《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》（1105）和《非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》（1106）中相关要求，决定采用稀释剂稀释法消除羟苯乙酯对结果的影响，用稀释剂制备成1﹕10的供试品溶液；采用平皿法中的倾注法对供试品中的需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数进行计数，根据草案对其质量标准中规定的大肠埃希菌进行检查，并对所选用的计数和检查方法进行验证。微生物限度检查法概述微生物限度检查法系检查非灭菌制剂及其原料药、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数及控制菌检查。微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。微生物计数试验和控制菌检查试验应在受控洁净环境下（D级）的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。本方案中的检验量即一次试验所用的供试品量（ml）。除另有规定外，一般供试品的检验量为10ml。检验时应从2个以上最小包装单位中抽取供试品。一般应随机抽取供试品，取规定容器数，混合，取规定量供试品进行检验。本方案中所使用的试验菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。制备菌液时应估算菌液中的含菌量，以便于控制加入试验菌的菌量，估算时可采用显微镜直接计数法确定。本方案中需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数），霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。本方案中微生物计数结果中需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最高的平均菌落数，计算1ml供试品中所含的微生物数。如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。控制菌检查中应取相当于1mL供试品的供试液进行试验。验证所需培养基、仪器设备试验用培养基pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；胰酪大豆胨液体培养基（TSB）；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）；沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）；麦康凯液体培养基；麦康凯琼脂培养基。本方案中所使用的培养基均应为购自中国食品药品检定研究院或由其他单位购买但经过适用性检查合格的脱水培养基，配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。仪器设备100级净化工作台；BSC-1100-L II A型生物安全柜；BP-II型药物天平；HHW21型电热恒温水浴箱；HY35型隔水式电热恒温培养箱；LRH-250A型生化培养箱；三洋MLS-3780型高压灭菌锅。微生物计数方法验证菌种及菌液制备金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕取金黄色葡萄球菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10 104〕取铜绿假单胞菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕取枯草芽孢杆菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量