细菌内毒素检查法.ppt

细菌内毒素检查法 主 要 内 容 细菌内毒素检查相关理论及概念 《中国药典》2010年版增修订情况 细菌内毒素检查法及注意事项 细菌内毒素检查相关理论及概念 细菌内毒素 鲎试剂 鲎试剂与内毒素的反应机理 细菌内毒素检查 名词解释 细菌内毒素检查法（Bacterial Endotoxins test） 热原检查法（Pyrogen test） LAL (Limulus amebocyte lysate) Test TAL (Tachypleus amebocyte lysate) Test Limulus Test 细菌内毒素的发现 细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。 细菌内毒素参考品的建立 不同细菌的内毒素对于鲎试剂的反应活性不同，为保证鲎实验法的平行性和重复性，要建立一种内毒素的标准物质作为实验中的控制标准。 由于大肠杆菌内毒素在天然内毒素中的致热活性比较高，在各种细菌内毒素对鲎试剂反应的灵敏性上处于中值的位置，且其稳定、可溶，因此一般都采用大肠杆菌的内毒素作为标准内毒素参考品。 鲎试验的发现 1956年Johns Hophins 大学动物学家Frederik. Bang发现革兰阴性细菌的粗制品能使鲎的血细胞凝聚。 1963～1964年 Jack.Levin和Bang对细菌引起鲎血凝聚进行研究，用内毒素和鲎血细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是一种酶反应。 多位学者对鲎血细胞溶解物（LAL）进行研究，阐释了凝聚机制 鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成 鲎试剂的种类： 依据鲎的种类分： 美洲鲎试剂（LAL） 中国鲎试剂（TAL） 圆尾鲎试剂（CAL） 依据检查方法分： 凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂 依据内毒素和鲎试剂反应的专一程度分： 普通鲎试剂和特异性鲎试剂 BET的目的和前提 确保药品不含有能导致患者发热反应发生的足量的细菌内毒素。 一定量的细菌内毒素可以被人体耐受，也是SFDA允许的。 前提是假定引起发热反应的热原几乎全部是内毒素。 二、2010年版《中国药典》细菌内毒素检查法增修订情况 2010版与2005版区别 修订背景 注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则 2010版与2005版区别 修订背景 1、细菌内毒素与检查用水除了强调内毒素含量外，还强调应对内毒素试验无干扰作用。 2、强调用干热灭菌法（ 250℃、30分钟以上）去除内毒素与热原法同步。 3、根据某些药（如抗肿瘤药）用体表面积计算给药量的需要，增加了按体表面积给药时的计算方法。 注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则 本原则依据2010年版药典制订，适用于注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查项目时进行的实验及研究。 需建立内毒素检查项目的品种 质量标准中有家兔热原检查法需转换为细菌内毒素检查方法的品种。 用于注射给药，但未有热原质量控制的品种。 注射用新药需建立热原质量控制的品种。 用于静脉给药的原辅料 建立方法时对鲎试剂及样品的要求 同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂 每个品种至少三批样品（上市品种应检测两个以上生产厂家；新药需检测连续生产的样品）。 确定内毒素限值 一般按公式L=K/M计算。M为人每公斤每小时临床最大用药剂量，依据药品使用说明书，《临床用药须知》确定。 儿童用药如大于成人，以儿童为准。 为保障安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2或1/3。 对于体积在100ml以上（包括100ml）的复方静脉输液类品种，内毒素限值一般按0.5EU/ml计。其他单方静脉输液品种除另有规定外也可按用药剂量计算，以EU/mg或EU/U表示。 对于美国、欧洲或日本药典已收载的，并已建立细菌内毒素检查法的品种可参考国外药典规定的限值，与按公式计算出的数值比较，以严格者为该品种的限值。如果使用的是国外药典的限值，应以最新版本药典为准。 干扰实验 建议使用较低灵敏度鲎试剂 (0.5EU/ml或0.25EU/ml),以避免供试品中内毒素的阳性影响。 三、细菌内毒素检查法 细菌内毒素检查法 定义：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内