质粒抽提-复旦大学上海医学院生物化学精品课程.ppt

质粒的快速抽提 复旦大学上海医学院 生物化学与分子生物学系 实验原理 1 碱裂解细菌 NaOH 染色体DNA变性 SDS 蛋白质变性 实验原理 实验步骤 1 细菌扩增 在原始平板上挑取待筛选菌落,接种到含AMP的LB液体培养基中,置于37度恒温摇床以200bpm的速度振荡培养过夜. 2 收集细菌 每个Eppendorf管收集1ml菌液,12000g离心后去除上清. 以上步骤由教师完成,学生从第三步开始做. 3 重悬 每一Eppendorf管中加入50ul试剂1 (10 mM EDTA pH 8.0),在涡流震荡器上震荡30秒重悬细菌. 4 裂解细菌 每一Eppendorf管加入50ul新鲜配制的试剂2(0.2M NaOH,0.5% SDS,20% 蔗糖),震荡30秒.70度水浴5分钟. 5 沉淀细菌DNA及蛋白,分离出质粒DNA 每管加入1.5ul试剂3(4M KCL)和0.5ul试剂4(0.4%溴酚蓝溶液),震荡30秒,冰浴5分钟.4度12000g离心3分钟. 6 制备0.7%琼脂糖凝胶(含0.5ug/ml EB) 7 电泳 取上清50ul上样于样品槽,电泳(电压5-10V/cm胶),待染料迁移至全胶长度2/3-3/4时,停止电泳,紫外检测电泳结果. DNA的琼脂糖凝胶电泳 1 琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α (1-3)和β (1-4)糖苷键交替构成的螺旋纤维 2 决定DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素: DNA分子的大小和DNA构象 琼脂糖浓度 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭(EB) 电压 琼脂糖种类 电泳缓冲液 等 DNA分子大小及构象对电泳迁移率的影响 1 双链DNA分子在凝胶迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比:分子越大,迁移越慢 2 超螺旋环状（SC）、切口环状（OC）和线状（L）DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。 配制琼脂糖凝胶的注意事项 1 微波炉加热到熔化 2 放置冷却至60℃后 加入 溴化乙锭（EB） 3 待胶凝固完全后上样电泳 4 注意电泳的正负极接口 （红色-正级 黑色-负极） 电泳方向为负 正 实验结果分析 思考题 为什么不同构象的DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中具有不同的迁移率? 在凝胶中添加溴化乙锭的作用原理是什么?溴化乙锭有哪些毒副作用?应如何避免? Thank you! * * 实验背景简介:什么是质粒? 扩增 质粒DNA 细菌染色体 DNA 质粒 目的基因 2 低温下用KCL沉淀变性的蛋白质和 染色体DNA 3 离心后从上清中分离出质粒DNA 裂解 沉淀 离心 致癌物： 注意戴手套防护 * * *