实验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定.pptVIP

实验 碱性磷酸酶的分离提取 目的要求： 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术 碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。 1.原理 在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作中特别注意以下几点： 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量高的材料。 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。 （3）盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法 高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。 各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。 硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。 2. 操作方法 2.1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取 每组称取25 g牡蛎（蒸馏水洗净），加入50 mL预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5，含0.1 mol/L NaCl），（两组一起）于高速组织捣碎机匀浆1 min，于冰箱4℃放置1 h左右进行抽提。 室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液并量体积（两组分开） 。（留3 mL上清液，待测酶的比活力。） 在上清液中加入研磨成细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g ）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h左右。 室温离心，4000 r/m 10 min，收集离心上清液，并量体积。（留3 mL上清液，对0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液pH 7.5含0.1 mol/L NaCl 透析平衡，待测酶的比活力。） (5) 0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨成细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g ）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置1-2 h。 (6) 室温离心，4000 r/m 10 min，收集沉淀物。 (7) 得到沉淀物，溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）。装入透析袋，对0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测出为止（可用一定浓度BaCl2溶液检验）。 (8) 取出酶溶液，冷冻高速离心（0℃ 25000 r/m 30 min）。 (9) 离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入棕色瓶于4℃冰箱保存。 25 g牡蛎 加入50 mL预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5，含0.1 mol/L NaCl），于高速组织捣粹机匀浆1 min，于冰箱4℃放置1 h左右进行抽提。 室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。（留3 mL上清液，待测酶的比活力。） 匀浆液 上清液 缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h左右。 室温离心，4000 r/m 10 min，收集离心上清液，并量体积。 （留3 mL上清液，待测酶的比活力。） 加入固体研磨成细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置1-2 h。 室温离心，4000 r/m 10 min，收集沉淀物。 0.35饱和硫酸铵上清液 沉淀 溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5。装入透析袋，对0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测出为止 粗酶液 离心机的使用 (1) 离心机要置水平位置，以保证旋转轴垂直地球水平面。 (2) 样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡，平衡后把它们放置于转子的对称位置。 (3) 盖好盖子，打开电源开关，调整离心时间和离心速度。 (4) 启动离心后等转速达到所要求的转速后才能离开(一般要2~3min)。 (6) 离心结束后要等到转速为零时才能打开离心机盖，取出样品。