应用抑制性消减杂交技术克隆肝炎病毒蛋白反式激活基因.pptVIP

乙型肝炎病毒的异质性 及临床意义 成 军 博士、教授 北京地坛医院 第一部分乙型肝炎病毒的血清型 1 决定因素乙型肝炎病毒的血清型，由膜主蛋白序列来决定。2 亲水结构区HBsAg有两个亲水区：32-76 aa和110-156 aa。HBsAg亲水赖氨酸改变，抗原活性消失。3 共同决定簇139-147 aa是共同簇抗原a必需的最小序列。 1 排斥决定簇主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇d/y （122-134 aa指令d/y决定簇）和w/r （159-160 aa指令w/r决定簇）。2 四个主要亚型组成4个主要亚型：adw、adr、ayw和ayr。 除了4个主要亚型外，还有adyr、adwr、adyw/aywr和adywr等复合亚型。不同亚型在外膜蛋白的前-S区序列和全基因组序列亦有相应的差异。 第二部分乙型肝炎病毒的基因型 HBV基因型的定义 分型方法是根据HBsAg主蛋白基因或全基因组核苷酸序列差异性进行的基因型分型，差异大于8%即被确定为另一基因型，按照这种分型方法，将HBV分为6种基因型，分别命名为A-F型，另有学者新定义了G、H型，尚待确定。 国内流行病学资料 国内主要的基因型为B、C两型，台湾省的研究资料提示除E型外，其他基因型均可在华人HBV感染者中检出，B和C型占患者人群的85%。 第三部分乙型肝炎病毒基因准种的特点 问 题 不同的慢性乙型肝炎患者之间血清中乙型肝炎病毒基因序列是不同的，因此可以根据序列的差别分成不同的血清型（adr、ayw、adw 等），也可以分成不同的基因型（A、B、C、D、E、F、G、H）。 问：同一个患者血液中不同的乙型肝炎病毒之间其基因序列是否相同？ 答：相同！或 不同！ 型与准种 基因型 （不同个体之间） 血清型 （不同个体之间） 准 种 （单一个体） 乙型肝炎病毒准种的定义 乙型肝炎病毒在长期复制过程中，由于逆转录过程其多聚酶缺乏严格的校正机制，从而产生自发点突变，造成子代病毒基因序列之间的微小差别，因而血清中的乙型肝炎病毒基因序列是不同的。这种差别一般小于全长基因组的5%。 有微小基因序列差别、但序列十分相近的乙型肝炎病毒组成的病毒群，这一病毒群时刻处于动态变化之中，乙型肝炎病毒的这种存在状态称为“准种”。 英文：quasispecies 为什么以前没有注意？方法比较 既往方案： 收集血清 ↓ 提取血清中HBV DNA ↓ 设计重叠PCR引物 ↓ PCR扩增 ↓ 产物直接测序 （单一克隆序列） 本研究方案 收集血清 ↓ 提取血清中HBV DNA ↓ 设计PCR引物 ↓ PCR扩增 ↓ TA克隆入质粒载体中 ↓ 随机选择单克隆测序 （多个克隆序列） S基因准种的特点（前-S1、前-S2、S） Protocol of Human Somatic Gene Therapy HBV全S基因RFLP结果 遗传树分析 HBV准种特点分析 ————————————————————— HBV DNA S Region HBV DNA X Region HBV DNA P Region HBV DNA C Region HBV DNA Pre-C 区 HBV DNA 全长 HBV DNA —————————————————————— 基因准种的个体化特点 HBsAg氨基酸序列 RT702 A3 MENTT-----LFGGA-----VPFAQWFAG- RT702A14 MENTT-----LFGGA-----VPFAQWFAG- RT702 B3 MENTT-----LFGGA-----VPFAQWFAG- RT702A10 MENTT-----LFGGA-----VPFAQWFAG- RT522 B7 MESTT-----LFGGA-----VPFVQWFVG- RT522 A5 MESTT-----LFGGA-----VPFVQWFVG- RT522B11 MESTT-----LFGGA-----VPFVQWFVG- RT XJ A2 MENTT-----LFGEA-----VPFVQWFVG- RT XJ A6