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杀虫剂离体(in vitro)筛选方法研究进展  传统的农药筛选方法   MTT（溴化-[3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基]四氮唑）法是二十世纪八十年代发展起来的一种快速、简便的体外抗癌药物敏感性的测试方法。目前已被广泛用于杀虫剂离体筛选实验。其作用的基本原理如下：活细胞线粒体中的琥玻酸脱氢酶能够还原黄色的溴化MTT为蓝紫色的不溶于水的甲臜（formazan），甲臜的生成量在通常情况下与活细胞数成正比。由于甲臜的生成量可通过酶标仪测定其在570nm处的吸收度（OD值）而测定，因此可根据OD值推测出活细胞的比例，测定化合物的杀虫活性。 3. 同位素示踪技术在杀虫剂离体中的应用 受体—配体结合分析法是一种灵敏，快速，简便，经济的离体生物活性测定方法，研究发现，利用合适的放射性配体作探针，检测受体—配体结合方式及强度，可用于杀虫剂分子的快速筛选。 配体与受体作用在作用于GABAA受体的杀虫剂筛选中常用的探针有[3H]EBOB（1-(4’-乙炔基苯基)-4-正丙基-2,6,7-三氧杂双环[2.2.2]辛烷），[3H]Ivermectin B1a,，[35S]TBPB（4-叔丁基-双环硫化磷酸酯），作用于烟碱乙酰胆碱受体的[3H]IMI（1-（6-氯-3-吡啶甲基）-N-硝基-咪唑烷-2-亚胺），作用于鱼尼汀受体的[3H] Ryanodine等。 [3H]EBOB 操作程序如下： 基因水平的杀虫剂离体筛选方法 1.电生理技术在杀虫剂离体筛选中的应用 2.荧光检测技术在杀虫剂离体筛选中的应用 3.其它基于不同受体的离体筛选方法 电生理技术在杀虫剂离体筛选中的应用 青蛙卵母细胞GABA受体电生理测定过程 荧光检测技术在杀虫剂离体筛选中的应用 钙离子敏感荧光染料 一些离子通道对钙离子通透，当被激活时，会引起细胞内钙离子浓度增高。因此使用钙敏感的荧光染料标记细胞内钙离子，实时监控细胞内钙离子浓度变化，可间接检测离子通道的活动。 电压敏感荧光染料 静息状态下，细胞膜两侧存在电位差，处于极化状态。当离子通道活动时，带电离子通过离子通道，改变膜两侧的电位差。根据这一原理，Molecular Devices 推出电压敏感染料免洗试剂盒。借助检测细胞膜两侧荧光信号的变化间接反应离子通道的活动。 将细胞孵育于一定的荧光指示剂和Mask dye 中，荧光指示剂附着于细胞膜外侧，并为Mask dye 所掩盖。当细胞膜上的离子通道打开或由其它原因导致细胞的去极化时，荧光指示剂移至细胞膜内侧，但Masking dye 不能进入细胞，荧光指示剂的荧光释放可以检测到荧光信号。 展望 武汉工程大学在农药研发方面的工作 仿制品种 除草剂 氟酮磺隆(flucarbazone) ; 氟丁酰草胺（beflubufamid） 嘧啶肟草醚（Pyribenzoxim); 丙炔氟草胺（flumioxazin); 环酯草醚（pyriftalid）。 刹虫剂 呋虫胺(dinotefuran) ; 环虫酰肼（chromafenozide); 氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor) 新型杀线虫剂(imicyafos) ; 啶虫丙醚(Pyridaly)；丁氟螨酯（Cyflumetofen); 联苯肼酯(Bifenazate) 。 刹菌剂 噻酰菌胺(tiadinil) ; 噻氟菌胺（thifuzamide）；氰霜唑（cyazofamid）; 喹螨醚（fenazaquin）； 新型杀线虫剂（imicyafos） ; 啶虫丙醚(Pyridaly) 。 * * 武汉工程大学 巨修练 介绍内容 一、传统的农药筛选方法 二、杀虫剂离体筛选方法 三、基因水平的杀虫剂离体筛选方法 杀虫剂 主要为活体筛选, 明显的不足是虫源一致性差、生长周期长、受外界条件影响大。 杀菌剂 主要为离体筛选，仍为目前的主要筛选方法。但筛选效率有待于提高。 除草剂 主要为活体筛选，仍为目前的主要筛选方法。但筛选重复性差、周期长、效率低。 杀虫剂离体筛选方法 传统的离体筛选方法 测定化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制；对酪氨酸酶的抑制；对线粒体呼吸酶活性的影响等。 2. 基于细胞水平的杀虫剂离体筛选 一般选用昆虫的初孵幼虫细胞，然后进行一定时间的培养后，用MTT发测定细胞存活率。 抑制率(%) = 100×(A-C)/ (A-B) A：表示总放射量值（dpm）； B：表示非特异性结合放射量值（dpm）； C：表示待测样品放射量值（dpm）。 亲和性测定实验过程 一组双环硫化磷酸酯类化合物的活性 化合物 （15） 化合物 （17