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PAGE胶电泳、转膜实验技术专辑 电泳带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。1937 年瑞典学者 A.W.K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪 ，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。? PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响,配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述。也可选择已经凝好的预制胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，实验结果更漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带完美。{ 拜力生物为您准备了所有电泳的试剂，包括上样buffer，SDS配胶试剂盒，电泳buffer、蛋白Marker和蛋白染色试剂盒。第一步：根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度进行凝胶的配制，可以使用SDS－PAGE凝胶配制试剂盒。第二步：进行蛋白变性，样品先置95℃的水浴加热5分钟，接着置冰浴中5分钟，10000g离心20分钟，取上清液（样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃可稳定保持数月）。蛋白上样缓冲液可以使用5×SDS蛋白上样缓冲液。第三步依次加入预染蛋白分子量标准和待分析样品。）} 基本操作流程：提取细胞或组织蛋白、测定大致含量↓制备SDS胶↓蛋白样品变性、电泳↓电泳转膜↓封闭（1小时）↓一抗(3小时左右或4度过夜)?↓TBST洗涤（洗三遍）↓HRP标记的二抗（1小时）↓TBST洗涤（洗四遍）↓ECL试剂作用↓X-光片曝光、显影↓结果分析 详细操作流程?1.试剂配制与订购1.1 .SDS蛋白上样缓冲液1.2 SDS凝胶配制1M Tris-HCl （pH6.8）:称取24.23g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调节pH值至6.8（约14ml），定容至200ml，121oC 20min灭菌，室温保存。1M Tris-HCl （pH8.0）:称取24.23g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调节pH值至8.0（约8.4ml），定容至200ml，121℃20min灭菌，室温保存。1.5M Tris-HCl （pH8.8）:称取36.34g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调节pH值至8.8（约5ml），定容至200ml，121℃20min灭菌，室温保存。10%（W/V）SDS:称取50gSDS，加400ml dd H2O，68℃加热溶解。滴加浓HCl调节pH值至7.2，定容至500ml，室温保存。30%（W/V）Acrylamide:称取29g Acrylamide，1g N，N’-至甲双丙烯酰胺（BIS），加dd H2O溶解，定容至100ml，用0.45m滤膜滤去杂质，4℃避光保存。0.02M PH 7.2 PBS：称取Na2HPO4·12H2O 5.8g，NaH2PO4·2H2O 0.59g，NaCl 8.5g，定溶至1000ml蒸馏水中。10%（W/V）过硫酸铵:称取0.1g过硫酸铵，加1ml dd H2O 充分溶解，4℃保存（有效期约为两周）。1.3 SDS电泳液5×Tris-Glycine Buffer （SDS电泳缓冲液）:称取15.1g Tris，94g Glycine，5gSDS，加ddH2O 充分溶解，定容至1L，室温保存。1×Tris-Glycine Buffer （SDS电泳缓冲液）:量取200ml 5×Tris-Glycine Buffer，定溶至1L，混匀，室温保存。1.4 NC膜（硝酸纤维素膜）PVDF膜1.5 Western转膜液称取2.9g Glycine，5.8g Tris，0.37g SDS，加ddH2O 充分溶解，定容至800ml，加入200ml甲醇，混匀，室温保存。1.6 洗涤液20×TBS:称取88g NaCl，加dd H2O充分溶解，加入100ml 1M Tris·HCl（pH8.0），定容至500ml，室温保存。TBST Buffer:量取50ml 20×TBS，0.5ml Tween 20，加dd H2O定容至1L，混匀，室温保存。1.7 封闭液称取5g脱脂奶粉，加入100ml TBST Buffer中，充分溶解，4 oC保存。1.8 一抗，二抗1.9 EasySee Western Blot Kit1.10 marker1.11 BCA蛋白定量试剂盒2. 蛋白样品制备2.1蛋白粗提在人体中IgG占总抗体80%，成人血清中含量为12.5%/ml左右，IgG粗纯一般用饱和(NH4)2SO4(SAS)进行，一般操作如下：1）8ml血清中加入8ml PBS（0.02 PH7.0），混