凝胶电泳技术.ppt.ppt

凝胶电泳技术 银染： 银染色液中的银离子(Ag )可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag 还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收。 EB的替代物： GoldView DNA染料是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA染料，使用方法与之完全相同。采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA时，GoldView与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，在某些波段甚至超过EB。在100ml琼脂糖胶溶液中加入5μl GoldView即可，亦可在电泳缓冲液中以同样比例稀释后直接使用。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链多聚核酸链呈红色荧光。因此，GoldView不仅能染双链DNA，也可用于染RNA和单链DNA。GoldView DNA染料在不同的波长下灵敏度有一定影响，建议使用312nm波长。 弱点是它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭，一般5-10min条带就会消失。 GeneFinder具有安全、灵敏等突出优点，可以代替溴化乙锭(EB)作为各种核酸电泳的染色剂。 ???? 与强致癌性的EB不同，GeneFinder?属于花青类染料，毒性很低，使用安全,可有效保护实验操作者和环境。 ???? GeneFinder?与dsDNA 结合荧光信号可增强800—1000倍，其检测核酸的灵敏度比EB染色法平均高10倍左右，与美国Molecular Probe公司的SYBR Green I染料的灵敏度相当。GeneFinder?染料最大吸收峰为470nm，与该染料结合的核酸呈现绿色荧光。 * * 电泳（electroghoresis）：带电物质在电场中向相反电极移动的现象 。 电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。 凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。 电泳的基本原理： 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。F＝QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即QE＝6πrην 球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。 电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度 迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 为了获得好的电泳结果，应尽量减少电荷效应，增加分子筛效应。 常用的凝胶电泳有两类 ： 琼脂糖凝胶电泳：分辨率稍低，适于较大分子 。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨率高，适于较小分子。 一、影响凝胶电泳迁移率的因素 （一）样品的物理性质 1、分子大小 线状双链DNA分子长度（碱基对数目bp）的对数（log10）与迁移距离成反比，以此来测定DNA片段（线性双链）的分子量准确且方便。 EB嵌合使迁移率下降15%。 当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 2、分子的空间构型：即使分子量相同，构型不同，其迁移率也不同。 DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：共价闭合环状DNA（covalently close circular DNA，ccc DNA，超螺旋构型） ＞lDNA（linear form，线型，质粒的两条链均断裂；线性分子）＞ocDNA（开环DNA，open cir