分子生物学实验石耀华.ppt

实验内容 1. 制备1%的常规琼脂糖凝胶，上样电泳； 2. 紫外光下切取目的DNA条带所在的凝胶块，修除去掉无DNA的凝胶部分； 3. 称量修理后的凝胶块重量，置于1.5 ml离心管中，加入3倍体积(V/W)的熔胶液碘化钠溶液； 4. 盖好离心管盖子，约55℃水浴至凝胶完全溶化； 5. 漩涡振荡混匀玻璃奶后取20 μl加入完全溶化的凝胶液中，室温颠倒混匀5 min； 玻璃奶法 【实验操作】 6. 室温、×12 000g离心30秒，小心吸除上清液； 7. 加入0.5 ml 漂洗液，混匀，室温、×12 000g离心30秒，小心吸除上清液； 8. 重复上一步两次； 9. 吸水纸上倒置，室温干燥约15 min； 10. 加入20 μl 除菌的TE或者去离子水，手指弹离心管底，混匀后55℃水浴5 min助溶； 11. 室温、×12 000g离心3 min，小心吸取上清液； 12. 取1 ul电泳检测回收效果。 1. 制备1%的常规琼脂糖凝胶，上样电泳； 2. 紫外光下从琼脂糖凝胶中切下目的条带凝胶块，修除去掉无DNA凝胶部分，称重量； 3. 置于1.5 ml离心管中，加入3-5倍体积的溶胶液PN，约55℃水浴至凝胶充分溶解； 4. 将500 μl平衡液BL 加入放置于收集管中吸附柱CA2中，室温、×12 000g离心30秒，倒掉收集管中的废液； 5. 水浴好的凝胶冷却至室温后转入上一步平衡后的吸附柱CA2中，室温放置2-5 min使DNA充分吸附； 普通DNA凝胶回收试剂盒法 6. 室温、×12 000g离心30秒，倒掉收集管中的废液； 7. 加700 μl漂洗液，放置2-5 min，室温、×12 000g离心30秒，倒掉收集管中的废液； 8. 重复步骤7； 9. 室温、×12 000g离心2 min，使吸附柱中的乙醇尽量除去； 10. 弃收集管，将吸附柱CA2中转入灭菌的干净1.5 ml离心管中，悬垂加入50-100 μl 60℃预热的洗脱液EB或者去离子水，室温或者50℃恒温箱中放置2-5 min，室温、×12 000g离心1 min； 11. 弃吸附柱，取1 ul收集液电泳检测。 １. 参照DNA marker，根据回收前、后电泳的条带亮度估计DNA的量，并计算DNA的回收率，评估你回收DNA的效果。 2．普通DNA凝胶回收试剂盒法步骤5、7、9中均放置2-5 min，分别有什么作用？ 3. 如果这三种方法任你选择，你会采用哪一种方法纯化回收PCR产物中的目的DNA分子？为什么？ 【作业与思考】 实验五 DNA重组克隆与鉴定 1. 掌握DNA重组和转化的基本原理； 2. 了解重组子鉴定筛选的原理与方法。 【实验目的】 【实验的基本原理】 基因克隆时的DNA重组常常是将待克隆的外源DNA分子与质粒载体进行连接组合；然后，采用热激处理，即感受态大肠杆菌与重组质粒冰浴混匀后迅速在42℃水浴中热激处理数十秒钟，细菌的细胞壁和细胞膜结构改变，生理生化状态也发生变化，从而将外源的质粒DNA摄入，包括重组子的吸附、导入、复制和表达等几个基本过程。转化后被转入的重组质粒在宿主细菌体内随着细菌的分裂增殖而迅速扩增，细菌获得了被转入的重组子的遗传物质，具有由此产生的新的遗传特征。 DNA重组转化基本原理 ?互补的蓝白筛选原理 质粒载体都含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子等调控序列和α肽链的DNA序列，该结构即为lac Z′基因，指导编码β-半乳糖苷酶N 端的146 个氨基酸。在编码区中插入了一个不破坏lacZ基因阅读框架的多克隆位点，不影响正常功能。宿主菌则具有β-半乳糖苷酶C 端编码区DNA序列。质粒载体没有转入宿主菌内时，二者相互独立，分别编码的是不完整的β-半乳糖苷酶区段，因而均没有β-半乳糖苷酶活性；一旦该质粒载体转入宿主菌中，质粒载体和宿主菌上的β-半乳糖苷酶基因片段相互结合互补，可以形成具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质，这种现象被称为α-互补。 当质粒中没有插入外源目的DNA片段时，质粒中的β-半乳糖苷酶基因与宿主菌中的β-半乳糖苷酶基因互补，在异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)的诱导下，形成活性的β-半乳糖苷酶。当培养基中加入5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)时，β-半乳糖苷酶就可以将X-gal分解为半乳糖和5-溴-4-靛蓝，后者为深蓝色，从而使菌落也呈现深蓝色。如果质粒的多克隆位点中插入了外源目的DNA片段，则质粒上β-半乳糖苷酶的α肽链编码区结构发生改变，不能合成原有的α肽链N端，进而不能与宿主菌中的β-半乳糖苷酶α肽链C端互补，不具备β-半乳糖苷酶活性，不能降解X-gal，此时菌落呈现白色。因此，导入含有目的DNA分子的重组子的阳性菌落显示白色，而导入的是没有目的DNA分子纯载体的阴性菌落则显示蓝