川续断基因组DNA的提取研究.docVIP

川续断基因组DNA的提取研究 　　摘要 川续断叶片中很有较多的蛋白质、多糖、酚类以及其他一些次生代谢物，采用传统的CTAB法很难得到高质量的DNA。试验以川续断叶片为材料，提出一种改良的CTAB法提取叶片基因组DNA，对提取的基因组DNA进行琼脂糖电泳检测及紫外分光光度计分析。利用中药材条形码ITS2序列的引物对提取的基因组DNA进行PCR验证。结果表明，改良的CTAB法得到的DNA质量较好，其OD260/OD280的值介于1.8～2.0之间，ITS2序列的引物PCR扩增成功率达到100%。改良的CTAB法为较为理想的川续断基因组DNA提取方法，获得的总DNA能够满足下游的PCR试验要求。 　　关键词 川续断；DNA提取；CTAB法 　　中图分类号 R282.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）02-0087-02 　　川续断（学名：Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai）为多年生草本，双子叶植物纲菊亚纲川续断目川续断科植物，高达2 m左右，生长在海拔1 200～2 500 m的高寒地区，具有耐寒喜湿等特点，为优良的中药原料；产于湖北、湖南、江西、广西、云南、贵州、四川和西藏等省区；根入药，有行血消肿、生肌止痛、续筋接骨、补肝肾、强腰膝、安胎的功效。目前有关川续断分子生物学方面的研究报道较少，尤其是对于川续断基因组DNA的提取报道不多。高质量的基因组DNA提取对于下游的分子生物学实验至关重要，提取过程中为了获取纯度高、降解少以及浓度高的DNA样品通常在研究中根据不同的需要，采取相应的策略尽量排除其他大分子成分如蛋白质、多糖等的污染[1]。川续断属植物酚类、多糖类物质含量较高，难以获取高质量的DNA。采用传统的CTAB法提取的基因组DNA，产量低易降解，酚类物质不能有效地去除，无法达到预期要求。为此，在本研究中，在经典的CTAB法基础上，做了一定的调整优化，旨在获得提取高质量川续断DNA的方法，为后续的分子生物学研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　以川续断幼嫩新鲜的叶片为材料，其采集于恩施三岔乡、新塘乡以及石窑等地，采集的样品立即放入冰袋保存，带回室内-20 ℃冰箱备用。 　　1.2 主要仪器与试剂 　　PCR仪（Bio-Rad）、研钵、电泳仪（北京六一）、凝胶成像仪（北京六一）、-20 ℃冰箱、超纯水系统、制冰机、超速冷冻离心机（SIGMA）以及其他相关设备。DNA提取相关试剂均为国产，购自上海生工。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 川续断总DNA的提取以及纯度浓度检测分析。在参照各文献报道的DNA提取和改进方法[2-3]的基础上，采用改良CTAB法[4]提取9个产地川续断叶片的总DNA，其具体试验步骤如下：取2～3 g叶片，放入液氮预冷的研钵，迅速研磨至粉末状，转移至10 mL离心管，加入6 mL的除酚缓冲液[100 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0），50 mmol/L EDTA-Na（pH值8.0），0.7 mol/L NaCl，2%（w/v）PVP40，用前添加2%（W/V）β-巯基乙醇]，涡旋振荡2～3 min后冰浴30 min，随后5 500 r/min离心15 min；弃上清液后，再次加入6 mL除酚缓冲液，涡旋混匀后冰浴静置15 min，5 500 r/min离心15 min，弃掉上清液；向沉淀中加入4 mL预热的CTAB提取缓冲液[3%（w/v）CTAB，100 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0），20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaC1，1%（w/v）PVP40，用前加β-巯基乙醇至终浓度为2%]，65 ℃水浴1.5 h，期间颠倒混合2～3次，取出冷却至室温，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），颠倒混匀2 min，11 000 r/min离心10 min，若上清液比较黏稠，可重复该步骤1次；离心后，小心吸取上清液至新的离心管中，加入1/2体积的5mmol/L NaCl以及2倍体积-20 ℃预冷的无水乙醇，混匀；-20 ℃静置2.5 h后，11 000 r/min离心10 min，弃掉上清液，用70%乙醇以及无水乙醇各洗1次后，将离心管重新放入离心机，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，用移液器吸取残留的乙醇，将含有沉淀的离心管放入超净工作台吹干5～10 min，以无乙醇气味为止。随后加入适量的灭菌双蒸水溶解DNA沉淀，待DNA完全溶解后加入1～2 μL的RNaseA（10 mg/mL），37 ℃保温1 h以出去RNA，于离心管中加入1 mL氯仿∶异戊醇（24∶1）轻轻上下颠倒10 min后11 000 r/min离心10 min