限制性内切酶的应用.pptVIP

第十一章　动物基因工程 基因工程的概念： 利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程. 第一节　基因工程的发展历程 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 改变营养组成 (第二代) 干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。 基因工程人干扰素α-2b（安达芬） 是我国第一个全国产化基因工程人干扰素α-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。 人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。 转基因鱼 生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国) 转基因牛 乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷) 转黄瓜抗青枯病基因的甜椒 转鱼抗寒基因的番茄 转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯 不会引起过敏的转基因大豆 第二节　基因工程的一般原理 一、常用的工具酶 二、基因工程的基本程序 一.分—载体和目的基因的分离 二.切—限制性内切酶的应用 三.接—载体与目的基因连接成重组体 四.转—基因序列转入细胞 五.筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定 基因克隆示意图 一.分—载体和目的基因的分离 （一）载体 1.质粒（plasmid) 2.噬菌体（phage) 3.动物病毒载体（virus) 质粒—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 理想的质粒 1.拷贝数多; 2.两三个抗药性基因 terr ampr 筛选标志 3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一） （二）.目的基因的来源和分离 1.PCR 2.基因组文库 3. cDNA文库 4.人工化学合成 二.切—限制性内切酶的应用 2.命名 例：Eco R I，这是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶 3.作用 限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是对DNA分子进行操作的手术刀。 Ⅱ型限制性内切酶的基本特征 ⑴在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割，使DNA双链断裂； ⑵识别序列一般为4~7个碱基对，这些碱基顺序大都是沿中心轴回转180°可以重合，也称回文序列。 ⑶能产生两种切割方式： 错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端 三.接—载体与目的基因连接成重组体 1.粘性末端连接 2.平端连接 四.转—基因序列转入细胞 　1.转化 　以质粒作为载体构建的重组DNA分子引入受体细胞的过程 　2.转染 　以噬菌体或或病毒为载体构建的重组DNA分子引入受体细胞的过程 五.筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定 　1.按重组载体的标志进行筛选 　2.核酸杂交法 　3. DNA限制性内切酶图谱分析 　4.PCR 　5.免疫学方法 1. 据重组载体的表型进行筛选 可以利用载体质粒对抗生素的抗药性进行筛选。 如质粒pBR332，由4362个核苷酸对构成对四环素及氨苄青霉素均有耐药性。 2. DNA 限制酶切图谱分析 提取重组DNA 经限制性内切酶切割 在琼脂糖凝胶电泳 比较重组体与原来载体 　　　从DNA片段的大小与有无来区别是否已发生重组。 3. 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定 将菌落DNA转移到硝酸纤维素滤膜上， 另外用放射同位素，标记目的基因，制成溶液，作为“探针” 将菌落DNA与“探针”一起温育，若菌落含有目的基因，就可把“探针”吸附住 把已和探针溶液作用过的滤膜冲洗、烘干，与线底片夹在一起放阴暗处数天，经显影后，有目的基因的所在位置会出现黑点，从黑点位置与菌落DNA比较及鉴定之。 克隆基因的表达 1.大肠杆菌表达系统 2.真核细胞表达系统 第三节 转基因动物技术 一、转基因动物的概念 转基因技术是将外源DNA导入细胞的一种技术。 它是在DNA重组技术的基础上发展起来的