流感禽流感红细胞凝集抑制试验抗体检测.docVIP

标准操作规程（SOP） 编号：CNICSOP0703 制定时间：200.01 制定人：王敏审核人：白天批准人：舒 跃 龙 生效日期：200.03 版本号：V-中国国家流感中心 流感/禽流感红细胞凝集抑制试验抗体检测 一、目的 二、范围 、程序 （一）生物安全要求 H5H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。 （二）材料 1抗原： 季节性流感病毒：人群中常见流行的流感病毒如A（H1N1）、A（H3N2）、B型流感病毒的标准参照抗原；禽流感病毒：灭活的流感病毒。2．血清： （1）季节性流感参比血清： A（H1N1）亚型标准抗血清 A（H3N2）亚型标准抗血清 B型Yamagata系标准抗血清 B型Victoria系标准抗血清（2）季节性流感待检血清：需急性期和恢复期双份血清。 （3）禽流感参比血清：由H5N1毒株制备的鸡血清。 （4）疑似禽流感病例待检血清：需急性期和恢复期双份血清。 3其他试剂： （1）红细胞悬液：常用鸡豚鼠、马红细胞悬液。红细胞悬液制备按照相关红细胞制备SOP进行。 （2）磷酸缓冲液（PBS），0.01M，pH 7. 2 将1包PBS粉剂（Sigma）溶于1000mL去离子水中。121高压灭菌，至4保存，保存期为3周。 ）生理盐水：0.85% NaCl 4其他： 96孔微量板： “U”型底微量板、”V”型底微量板（Corning） 37℃水浴锅 56℃水浴锅 台式离心机 多道可调加样器 离心管 （三）1．按《血清处理SOP》处理血清。 2按表所列条件选择红细胞凝集板和实验条件。 流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较 红细胞 鸡 豚鼠 马 适用范围 流感禽流感流感禽流感终浓度0.5 0. 5 0.5 孔底部形状 U或V型 U型 U型 孵育时间 3060min 60min 细胞对照 细胞沉积成，倾斜时细胞向下流成泪滴状， 细胞沉积成环状 细胞沉积成环状 注：由于“O”相毒株不能凝集鸡红细胞，所以在对该种病毒进行鉴定时应使用豚鼠红细胞。 3红细胞凝集试验（HA）检测滴度，具体操作见流感/禽流感病毒红细胞凝集抑制试验鉴定SOP。 4制备用于红细胞凝集抑制试验的4个红细胞凝集单位的抗原，具体操作见流感/禽流感病毒红细胞凝集抑制试验鉴定SOP。 5红细胞凝集抑制试验（HI）检测血清抗体 （1）流感鉴定常用的4种参比抗原： 1）A（H1N1）亚型代表毒株参比抗原 2）A（H3N2）亚型代表毒株参比抗原 3）B型Yamagata系代表毒株参比抗原 4）B型Victoria系代表毒株参比抗原 禽流感鉴定抗原：采用国家流感中心提供的参比抗原。 （2）流感血清抗体鉴定： 根据所用红细胞选用适当的微量板，须设立血清对照板。将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行方向称行，如A1～12称为A行。 1）除A行外，每孔加入25μL PBS缓冲液。 2）按以下顺序，A行各孔加入处理过的血清50μL。 A1：待检血清标本1，急性期血清 A2：待检血清标本1，恢复期血清 A3：待检血清标本2，急性期血清 A4：待检血清标本2，恢复期血清 A5：待检血清标本3，急性期血清 A6：待检血清标本3，恢复期血清 A7：待检血清标本4，急性期血清 A8：待检血清标本4，恢复期血清 A9：A（H1N1）亚型标准抗血清 A10：A（H3N2）亚型标准抗血清 A11：B型Yamagata系标准抗血清 A12：B型Victoria系标准抗血清 3）用多道加样器从A行各孔分别吸取25μL血清，由A行至H行进行2倍稀释血清，弃去H行最后25μL。 4）红细胞凝集抑制试验板每孔加入25μL新配制的4个凝集单位的抗原。 5）血清对照板每孔加入25μLPBS。 6）轻轻弹击微量板，使抗原与抗体充分混合。 7）室温孵育min。 8）每孔加入50μL红细胞悬液，混匀。 9）孵育。10）观察红细胞凝集抑制试验结果，对照板应不出现凝集。 （3）禽流感血清抗体鉴定： 1）每孔各加25μL PBS。 2）A1加入标准诊断血清作为阳性对照；A2加入H5N1阴性血清作为阴性对照。 3）若未知血清来源省份为已有禽流感病例、并分离到禽流感病毒的省份，用该省的抗原作为鉴定未知血清的检测抗原，自A3开始分别加入不同待检血清25μL；若未知血清来源省份为其它省份，则使用作为检测抗原，自A3开始每三孔加入同样待检血清，各25μL。采用急性期和恢复期血清作对照。 4）用多道加样器从A行分别取25μL血清，由A行至H行做2倍系列稀释血清，弃去H行25μL。 5）A1、A2列加入抗原25μL，A3列开始加入待检血清对应的检测抗原25μL（4个凝集单位的抗原）。 6）混匀，置室