肉毒梭菌及其毒素检验.ppt

知识目标： 理解肉毒梭菌的生物学特性。 了解肉毒梭菌及其毒素的致病性。 掌握肉毒梭菌及其毒素标准检验方法。 肉毒梭菌 肉毒梭菌是一种腐物寄生菌，在自然界分布很广，土壤、霉干草和畜禽粪便中均有存在，可分为A至G七个型。 引起肉毒中毒主要是食入含有肉毒毒素的食品，食品在调制加工、运输贮存的过程中，污染了肉毒梭菌芽胞，在适宜条件下，发芽、增殖并产生毒素所造成的。 国外引起肉毒中毒的食品多为肉类及各种鱼、肉制品、火腿、腊肠以及豆类、蔬菜和水果罐头。 中毒食品种类往往与饮食习惯有关。如欧洲各国主要的中毒食品为火腿、腊肠和其他兽肉、禽肉等。美国主要是家庭制的水果罐头，而火腿、腊肠等畜禽肉加工食品仅占7.7%，日本和俄罗斯等国家鱼制品中毒者最多，尤其是日本，几乎全部是鱼制品的E型中毒。 国内因肉类食品及罐头食品引起的中毒的较少，据有关资料调查统计，主要是臭豆腐、豆鼓、面酱、红豆制品、烂土豆等植物性食品引起的中毒多见。 肉毒梭菌的抵抗力一般，但其芽胞的抵抗力很大，可耐煮沸1～6小时之久，于180℃干热5～15分钟才能破坏，120℃高压蒸气下10～20分钟才能杀死。10%盐酸须经1小时才能破坏。在酒精中能存活2个月。其中以A、B型菌的芽胞抵抗力最强。这一点对于罐头食品的灭菌很重要，若芽胞深藏于食品中，或者数量过多，虽经高温灭菌，有时也不易杀死芽胞，故应特别注意。肉毒毒素抵抗力也较强，80℃30分钟或100℃10分钟才能完全破坏。正常胃液和消化酶于24小时不能将其破坏，可被胃肠道吸收而中毒。 一、生物学性状 培养特性：本菌为最严格的厌氧菌，对营养要求不高，在普通培养基上都能生长。发育最适宜温度为28～37℃，pH为6.8～7.6，产毒的最适pH为7.8～8.2。 血清琼脂：培养48～72小时，形成中央隆起，边缘不整齐、灰白色、表面较粗糙的绒球状菌落。直径可达6～10mm。 血液琼脂：菌落周围有溶血区。 培养特性： 普通琼脂：形成灰白色、半透明、边缘不整齐。呈绒毛网状、向外扩散的菌落。直径约为3～5mm。 肉渣肉汤：呈均匀混浊生长，肉渣可被A、B和F型菌消化溶解成烂泥状，并发黑，产生腐败恶臭味，从第三天起，菌体下沉，肉汤变清。在肉渣培养基和半固体培养基，大量产气。 生化特征 本菌生化特性很不规律，一般能分解葡萄糖、麦芽糖、果糖产酸产气。对明胶、凝固血清、凝固蛋白均有分解作用，并引起液化。不形成靛基质，能产生硫化氢。 菌型及毒素 目前已知肉毒梭菌有A、B、C、D、E、F、G等7个菌型，其中C型还有Cα和Cβ两个亚型。引起人群中毒的主要是A、B、E三型，C、D型主要是畜禽肉毒中毒的病原，F型只见报导发生在个别地区的人，如丹麦和美国各一起。1980年从瑞士五名突然死亡病例中发现G型毒素。 各型肉毒梭菌产生相应型的毒素，所以肉毒毒素也分为A、B、C、D、E、F、G等7型，C型包括Cα和Cβ两个亚型。 肉毒毒素是在肉毒梭菌胞浆中产生，由菌体释放到培养基中，经滤过除菌所得滤液即为毒素液。毒素形成的最适宜温度为28～37℃，温度低于8℃与pH在4.0以下时，则不能形成。 肉毒梭菌产生的毒素是一种神经毒素，是目前已知的化学毒物与生物毒素中毒性最强的一种，对人的致死量为10-9mg/Kg体重。其毒力比氰化钾还要大一万倍。 二、致病性 肉毒毒素是一种与神经亲和力较强的毒素，肉毒毒素经肠道吸收后，作用于外周神经肌肉接头，植物神经末梢以及颅脑神经核，毒素能阻止乙酰胆碱的释放，导致肌肉麻痹和神经功能不全。在临床上表现以中枢神经系统中毒症状为主，肉毒毒素中毒潜伏期长短不一，短者2小时，长者可达数天，一般为12～24小时。中毒症状，早期为瞳孔放大、明显无力、虚弱、晕眩，继而出现视觉不清和雾视，愈来愈感到说话和吞噬困难，通常还可见到呼吸困难，体温一般正常，胃肠道症状不明显。病程一般为2～3天，也有的长达2周之久。肉毒中毒死亡率较高，据报导可达30%～50%，死亡主要是由于呼吸麻痹及心肌痪瘫。如早期使用型特异或多价抗血清治疗，死亡率可降至10%～15%。 三、检验方法 《中华人民共和国国家标准—食品卫生检验方法（微生物学部分）》肉毒梭菌及其毒素的检验方法 GB4789.12-2003 。 《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》食品中肉毒梭菌的PCR检测方法SN/T2525-2010 。 （一）肉毒毒素检验 液体检样可直接离心，固体或半流动检样须加适量（例如等量、倍量或5倍量、10倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后，取上清液进行检测。 另取一部分上清液，调pH6.2，每份加10%胰酶（活力1：250）水溶液1份，混匀，不继轻轻搅动，37℃作用60min，进行检测。 试验方法：取样品处理完的上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠三只，每只0.5mL，观察4d。 结