Hela细胞转染实验要素.pdf

Hela 细胞的传代培养及生长周期观察 HE 染色观察 高学敏 生36 2013012322 一、实验背景 （一）关于Hela 细胞 Hela 细胞是源自美国妇女Henrietta Lacks 的子宫颈癌细胞，取于1951 年， 属于增殖型表皮癌细胞。在体外培养条件下，经过筛选，目前实验使用的Hela 细胞为无限细胞系，在适宜条件下可以无限分裂，不会衰退，可以连续传代。 经过六十多年，Hela 细胞已经被培养出多个细胞系，它几乎成为细胞生物学中 的一种“模式生物”。似癌细胞的特征，其核型已非二倍体型，而是非整数倍体 （aneuploid ）。2013 年Andrew Adey 等人在Nature 发表的研究表明，Hela 细胞 的基因组相当稳定，可将不同细胞系区分开的点突变和基因拷贝数改变相当少 1，这是Hela 细胞的一大特点。 （二）原代培养、传代培养、衰退 进行细胞体外培养前，最初需要从活体中获得细胞。从体内获得细胞进行 的首次培养为原代培养。当原代培养细胞增殖达到一定密度后，需要做继代培 养，被称为传代培养。 细胞在体外培养过程中的群体生存状况与在完整机体内的生存与衰老死亡 基本一致；本次所做的Hela 细胞实验为Hela 细胞传代实验，即将已长到相当 密度的原培养皿中的Hela 细胞转移至新培养皿中培养。 在原代培养期，细胞增殖能力弱，第一次传代后，部分细胞可以重新贴 壁，此时细胞增殖能力增强；另外亦是为了获得更多的细胞，因此进行传代操 作。 培养的组织细胞在体外可以反复传代十几次左右，若传代十几次后细胞进 入衰退阶段并死亡，则该细胞系称为有限细胞系；若在衰退阶段，部分细胞的 遗传特性发生改变，可以无限传代，则该部分细胞将发展为无限细胞系。Hela 细胞系即为无限细胞系，已历经六十多年的传代培养。 （三）贴附型细胞与悬浮型细胞 在体外培养时，根据细胞能否贴附于支持物上分为贴附型细胞和悬浮型细 胞两类。大多数细胞系属于贴附型细胞，血液中的白细胞和某些癌细胞属于悬 浮型细胞。Hela 细胞属于贴附型细胞，它需要贴附于支持物上才可能存活并增 殖。 （四）两次传代之间的细胞周期 在两次传代之间，未更换培养基时，细胞经历一个生长周期。刚进行传代 后，细胞处于潜伏期。潜伏期中细胞适应新环境，贴附型细胞重新贴壁，因此 潜伏期又可细分为游离期与贴附期。 潜伏期结束后细胞进入指数生长期，指数生长期中已贴壁的细胞快速进行 有丝分裂，使得培养皿中细胞密度快速增加。有丝分裂前，Hela 细胞圆化，似 与周围贴壁的未进行分裂的细胞分离，在实验条件下，Hela 细胞的细胞周期约 为24 小时。多数普通细胞存在接触抑制现象，即当平皿中的细胞相互接触，密 度达到 100%时细胞将停止分裂。但是许多癌细胞不存在接触抑制现象，Hela 细胞属于不存在接触抑制现象的细胞。指数生长期后，平皿中细胞密度可达 100%，甚至存在数层Hela 细胞，此后细胞生长进入平台期。 平台期，Hela 细胞不继续进行增殖，群体共同生存一段时间。若不更换培 养基，细胞群体将进入衰退期。衰退期间，即将死亡或死亡细胞脱离上浮，仍 然贴壁的细胞内颗粒增加，细胞状态渐差，贴壁细胞密度开始逐渐降低。 本次实验中，在Hela 细胞培养的近1 周时间内，未曾更换培养基，由于代 谢废物在培养基中的积累、营养物质被消耗、细胞大量增殖等原因，培养皿中 的Hela 细胞将经历完整的一个生长周期。 （五）细胞体外培养的培养基与培养条件、进行传代操作时使用的消化液 细胞在体外培养时，需要提供与体内近似的环境。这些环境因素包括：基 本营养物质、生长刺激因子、水、温度、pH 条件、无菌的环境、湿度、光照、 气体环境等。本次实验采用90%DMEM 高糖培养基加上10%胎牛血清与各 1% 的青霉素与链霉素组成混合细胞培养液。DMEM 培养基可供给细胞合适的营养 物质及pH 条件等，胎牛血清可供给细胞某些仍然未知的生长因子，两种抗生 素可提供一定的抑制其他微生物生长的作用，但并不能保证一定不会有其他微 生物生长，因此进行操作时，注意无菌操作才是避免污染的核心。抗生素的作 用效果随时间逐渐衰退，且抗生素对于细胞有一定毒性。 将Hela 细胞置于37℃，5% CO 培养箱中培养。一方面由于37℃为人体温